歐陽少倫，藍(lán) 草，陳文銳，安文佳，林 峰，莊燕君

（廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510623）

隨著工業(yè)化的迅速發(fā)展，工業(yè)污水和環(huán)境污染日益嚴(yán)重，加之一些地區(qū)養(yǎng)殖密度過高，飼料質(zhì)量差，致使水生生物抵抗力低、發(fā)病率增加。為了治療和預(yù)防各種病害、提高產(chǎn)量效益，水產(chǎn)品的養(yǎng)殖過程中存在誤用、濫用各種藥物的情況，主要包括三苯甲烷類染料、四環(huán)素類、氯霉素類、磺胺類、喹諾酮類等。人們長(zhǎng)期食用含漁藥殘留的水產(chǎn)品，藥物易在人體內(nèi)蓄積，可能會(huì)產(chǎn)生致畸、致癌的嚴(yán)重危害［1］，有些漁藥殘留會(huì)間接增強(qiáng)人體病原菌的耐藥性，增加治療難度。因此，世界各國對(duì)水產(chǎn)品中的獸藥殘留限量做了嚴(yán)格規(guī)定［2］。

目前對(duì)水產(chǎn)品中獸藥殘留的檢測(cè)方法主要以氣相色譜法（GC）［3－4］、液相色譜法（HPLC）［5－6］、氣相色譜－質(zhì)譜法（GC－MS）［7－8］、液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法（LC－MS/MS）［9－12］、液相色譜－飛行時(shí)間質(zhì)譜法（LC－TOF MS）［13－14］和液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法（LC－HRMS）［15－16］為主。但現(xiàn)有研究檢測(cè)的藥物種類單一，前處理凈化步驟較多，高通量檢測(cè)仍具有一定的局限性。水產(chǎn)品中獸藥殘留檢測(cè)已趨向多種類、高通量發(fā)展［17］，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道了牛奶［18－19］、飼料［20］、豬肉［21］等基質(zhì)中獸藥殘留的測(cè)定方法，但在水產(chǎn)品中獸藥多殘留高通量快速篩查方面的研究鮮有報(bào)道。

在線凈化技術(shù)TurboFlow主要通過擴(kuò)散溶解、體積排阻等手段達(dá)到凈化目的，比傳統(tǒng)的固相萃取和基質(zhì)分散萃取更具優(yōu)勢(shì)，已在食品領(lǐng)域得到了較好的應(yīng)用［22－23］。本文建立了在線凈化/液相色譜－四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜高通量篩查水產(chǎn)品中123種獸藥殘留的方法，包括20種磺胺類、6種大環(huán)內(nèi)酯類、16種喹諾酮類、12種β-激動(dòng)劑、17種苯并咪唑類、4種四環(huán)素類、2種鎮(zhèn)靜劑、6種激素、4種β-內(nèi)酰胺類、1種氨苯砜、2種抗球蟲藥、2種染料、24種糖皮質(zhì)激素、1種氯霉素、6種雷索酸內(nèi)酯類。該方法前處理簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于大批量水產(chǎn)品中多種獸藥殘留的快速篩查。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

乙腈、甲醇、丙酮、異丙醇（HPLC級(jí)，F(xiàn)isher Scientific公司）；甲酸（分析純，Merck公司）；所用試劑除注明外均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。123種化合物的標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司、德國Witega公司、美國Sigma公司、北京振翔公司、中國食品藥品檢定研究院、上海安譜公司，純度為91.2%～99.9%。

Transcend TLX在線凈化液相色譜Q－Exactive靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜分析系統(tǒng)（由雙流路大體積大容量自動(dòng)進(jìn)樣器、1個(gè)低壓四元泵、1個(gè)高壓二元泵和Q－Exactive－Orbitrap質(zhì)譜儀組成，美國Thermo Fisher公司）。Milli－Q超純水器（美國Millipore公司）；CPA22SD分析天平、BT 124S分析天平（Sartorius公司）；SiGMA 1－14高速離心機(jī)（德國Sigma公司）；MS3 basic旋渦振蕩器（IKA公司）；Promax 2020水平振蕩器（德國Heidolph公司）；S300H超聲波水?。ǖ聡鳨lma公司）。

數(shù)據(jù)處理軟件：TraceFinder EFS、Xcalibur、Aria均為美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇、乙腈或水等溶劑溶解并定容至10 mL，配制為1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，置于－18℃保存。使用時(shí)根據(jù)需要將化合物分組用甲醇進(jìn)行混合或稀釋，所有稀釋液均置于4℃下避光保存。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件在線凈化程序主要為凈化和分離過程，凈化過程（TFC）由上樣泵驅(qū)動(dòng)凈化流動(dòng)相在TurboFlow柱上完成，分離過程（LC）由分離泵驅(qū)動(dòng)分析流動(dòng)相在分析柱上完成。整個(gè)程序通過切換2個(gè)六通閥使流路改變，實(shí)現(xiàn)在線凈化富集。

TurboFlow凈化柱：CycloneTMP（0.5 mm×50 mm，Thermo Fisher Scientific公司），凈化泵流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇，C為乙腈，D為丙酮∶異丙醇∶乙腈（20∶40∶40，體積比）。柱溫：室溫，進(jìn)樣量：50μL。

色譜柱：Atlantis T3（100 mm×4.6 mm，3μm，Waters公司）；柱溫：35℃。流動(dòng)相：正離子檢測(cè)和負(fù)離子檢測(cè)（糖皮質(zhì)激素）時(shí)，A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；負(fù)離子檢測(cè)（除糖皮質(zhì)激素外）時(shí)，A為水，B為乙腈。梯度洗脫程序見表1。

表1 在線凈化梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure of TurboFlow on-line cleanup

1.3.2質(zhì)譜條件Q－Exactive－Orbitrap質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher公司），配有電噴霧離子源（ESI）。正或負(fù)離子化模式；掃描范圍：m/z100～1 000；一級(jí)全掃描分辨率：R=70 000；噴霧電壓：3 500 V；鞘氣流速：40 arb；輔助氣流速：7 arb；毛細(xì)管溫度：320℃；包含列表：on；離子最大容納數(shù)量：1e6；離子最大注入時(shí)間：100 ms；二級(jí)離子全掃描分辨率：17 500；歸一化碰撞能量：20%、40%、60%。其他質(zhì)譜信息見表2。

表2 123種獸藥的名稱、分子式、部分質(zhì)譜參數(shù)和定量下限Table 2 Names，formulas，some MS parameters and LOQs of 123 veterinary drugs

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

1.4 樣品前處理

稱取5 g均質(zhì)樣品（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入7.5 mL乙腈－水（8∶2，體積比，下同）溶液，渦旋1 min，超聲15 min，水平振蕩15 min，以4 500 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中；殘?jiān)偌尤?.5 mL乙腈－水（8∶2）溶液，用玻棒搗碎下層殘?jiān)?，水平振?5 min，以4 500 r/min離心5 min，上清液合并于50 mL離心管中混勻，取適量樣液經(jīng)0.2μm濾膜過濾后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了乙腈－水（8∶2）溶液、乙腈和1%乙酸乙腈3種提取溶劑對(duì)目標(biāo)化合物的提取效率。結(jié)果表明，乙腈對(duì)大部分目標(biāo)分析物的提取效果好，且能有效地沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，但部分目標(biāo)分析物（如β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類藥物）的極性較大，提取劑中需加入水才能得到較好的提取效率；而喹諾酮類藥物在弱酸性條件下的提取效率更高。對(duì)于苯并咪唑類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類等獸藥，上述3種提取溶劑均有很好的提取效率，其中乙腈－水（8∶2）溶液的提取效率略高；倍他米松、地塞米松、可的松醋酸醋和潑尼松龍醋酸酯在乙腈中的提取效率很低，可的松醋酸酯和潑尼松龍醋酸酯采用1%乙酸乙腈時(shí)的提取效率極低；對(duì)于噴布特羅、萊克多巴胺、苯氧丙酚胺、馬布特羅、溴代克侖特羅、馬噴特羅、溴布特羅、四環(huán)素類，以乙腈為提取溶劑時(shí)的提取效率很低，乙腈－水（8∶2）溶液的提取效率略高于1%乙酸乙腈。綜合考慮目標(biāo)分析物的檢測(cè)濃度水平和提取效率，本實(shí)驗(yàn)采用乙腈－水（8∶2）溶液作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

水產(chǎn)品本底復(fù)雜，會(huì)帶入脂肪、類脂及其它干擾組分。目前的在線凈化技術(shù)主要分為兩類：一類是簡(jiǎn)單的SPE柱，可去除部分樣品雜質(zhì)，但不能有效去除脂類物質(zhì)，需要額外的離線去除脂肪步驟；另一類是在線凈化，凈化柱可同時(shí)去除脂肪等類脂類物質(zhì)，樣品無需額外的離線去除脂肪步驟。本研究采用的TurboFlow技術(shù)屬于第二類在線凈化技術(shù)，流路示意圖見圖1。

圖1 TurboFlow整體流路示意圖Fig.1 Schematic diagram of overall velocity path of TurboFlow

TurboFlow色譜柱由50～100μm大粒徑填料填充而成，具有體積排阻作用和化學(xué)作用力。當(dāng)使用大流速時(shí)（如2 mL/min），流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)形成湍流，在高流速下小分子化合物有足夠的時(shí)間快速擴(kuò)散進(jìn)入柱填料顆粒表面的小孔中，通過與填料表面的鍵合相相互作用保留在色譜柱上；保留較弱的小分子干擾物排出色譜系統(tǒng)（例如磷脂、鹽類、糖類），而大分子化合物（主要為蛋白）由于擴(kuò)散速度慢而沒有足夠的時(shí)間擴(kuò)散到填料表面或內(nèi)部，故不能保留在色譜柱上而被直接沖至廢液中。TurboFlow技術(shù)可實(shí)現(xiàn)一次性去除樣品中的磷脂、鹽類、蛋白等干擾物，實(shí)現(xiàn)快速高效的分離凈化。其在線凈化過程主要包括上樣、洗脫轉(zhuǎn)移和條件化3個(gè)步驟。本研究分別對(duì)TurboFlow的上柱條件、洗脫條件和凈化柱類型進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2.1上柱條件的優(yōu)化采用不接分析柱，分流進(jìn)質(zhì)譜方式優(yōu)化上柱條件。分別考察了0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸水溶液－乙腈（98∶2）、0.1%甲酸水溶液－乙腈（95∶5）、0.1%甲酸水溶液－乙腈（90∶10）、0.1%甲酸水溶液－乙腈（75∶25）5種上柱溶劑對(duì)分析物保留的影響。結(jié)果表明：當(dāng)有機(jī)相比例增至2%時(shí)，分析物在上柱步驟有不同程度的損失，隨著有機(jī)相比例的增加，分析物的損失不斷增大，在凈化柱的保留程度越低。因此，實(shí)驗(yàn)采用0.1%甲酸水溶液作為上柱溶劑。

2.2.2洗脫條件的優(yōu)化采用0.1%甲酸水溶液分別配制25%乙腈、50%乙腈、75%乙腈、100%乙腈、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇和100%甲醇作為洗脫溶劑，考察了各類代表性藥物在不同洗脫溶劑下的回收率。結(jié)果表明，當(dāng)洗脫溶劑的有機(jī)相比例高于水相時(shí)，由于有機(jī)溶劑比例過高導(dǎo)致溶劑不匹配，大部分物質(zhì)的色譜峰前延嚴(yán)重或開叉。比較有機(jī)溶劑比例較低的4個(gè)洗脫條件發(fā)現(xiàn)，除了噻苯噠唑、克林霉素、乙?；前贰⒒前烽g甲氧嘧啶和氯羥吡啶等獸藥，乙腈對(duì)其他大部分目標(biāo)分析物的洗脫能力優(yōu)于甲醇。除了糖皮質(zhì)激素類，25%乙腈對(duì)大部分目標(biāo)分析物的洗脫效果優(yōu)于50%乙腈。綜合考慮，選擇25%乙腈作為洗脫溶劑。

2.2.3在線凈化柱的選擇由于目標(biāo)分析物大部分為極性或中等極性，實(shí)驗(yàn)對(duì)比了反相苯基鍵合硅膠CycloneTMP柱（0.5 mm×50 mm）和鍵合硅膠C18凈化柱（0.5 mm×50 mm）對(duì)目標(biāo)分析物的回收率。采用樣品空白基質(zhì)配制質(zhì)量濃度為10μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上樣，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，部分代表性化合物的回收率見圖2。結(jié)果表明，多數(shù)目標(biāo)分析物在CycloneTMP柱上的保留更好。綜合考慮，選擇CycloneTMP作為凈化柱。

圖2 代表性藥物在CycloneTM P和C18柱上的回收率Fig.2 Recoveries of representative drugs on Cyclone TM P and C18 columns

2.3 藥物的定性分析

采用Full Scan/ddMS2模式對(duì)123種化合物進(jìn)行掃描，獲得目標(biāo)物的保留時(shí)間、母離子及二級(jí)質(zhì)譜圖等信息。采用mzVault軟件建立標(biāo)準(zhǔn)二級(jí)譜庫，每種目標(biāo)物包含多個(gè)特征離子，結(jié)合化合物的結(jié)構(gòu)、裂解原理選擇相對(duì)豐度較高的2個(gè)離子作為特征碎片離子，見表2。通過Exactfinder軟件導(dǎo)入包含化合物名稱、分子式、精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間和特征碎片的表格，并通過Librarymanager軟件導(dǎo)入二級(jí)質(zhì)譜圖，建立了定性篩查數(shù)據(jù)庫。設(shè)置篩查參數(shù)要求提取母離子精確質(zhì)量數(shù)與理論質(zhì)量數(shù)的相對(duì)偏差≤5×10－6，二級(jí)碎片離子精確質(zhì)量數(shù)的相對(duì)偏差≤10×10－6，保留時(shí)間偏移0.5 min，最小響應(yīng)為10 000，軟件匹配度不小于90%。

參考《獸藥殘留檢測(cè)中質(zhì)譜方法確證指南》［24］、《食品法典委員會(huì)食品中獸藥殘留物的最大殘留限度（MRLs）和風(fēng)險(xiǎn)管理建議》［25］，按照目標(biāo)分析物的定量下限作為篩查截止?jié)舛冗M(jìn)行方法試驗(yàn)，結(jié)果表明本篩查方法在截止?jié)舛人缴系募訇幮月剩é抡`差）＜5%，符合歐盟2002/657/EC決議［26］規(guī)定的篩選方法性能指標(biāo)要求。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法考察基質(zhì)效應(yīng)，分別配制空白基質(zhì)工作曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線，按下式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（ME）：ME=B/A，A和B分別表示溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中藥物的峰面積。當(dāng)ME大于1時(shí)，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)ME小于1時(shí)，表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；當(dāng)ME等于1時(shí)，表明無基質(zhì)效應(yīng)或基質(zhì)效應(yīng)很弱。結(jié)果表明，大部分化合物的ME小于1，存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，本方法采用樣品空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量檢測(cè)。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

根據(jù)各藥物的檢出限選擇合適質(zhì)量濃度范圍（0.05～50μg/L）配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按本方法進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，123種藥物在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99。因目標(biāo)分析物同時(shí)存在禁用和限用藥物，所以本方法的定量下限（LOQ）為各目標(biāo)分析物的最低加標(biāo)濃度，123種藥物的LOQ為0.1～50μg/kg（見表2）。以草魚空白樣品為基質(zhì)，按各藥物的LOQ、2LOQ、10LOQ為加標(biāo)水平進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，各加標(biāo)水平平行測(cè)定6次。結(jié)果顯示，123種藥物的回收率為53.7%～129%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.7%～19%，方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足檢測(cè)要求。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)100份水產(chǎn)樣品（包括草魚、鯽魚、黃骨魚、鱸魚、多寶魚等）進(jìn)行篩查，檢測(cè)結(jié)果與二級(jí)譜庫的匹配度均大于90%，其中有6個(gè)樣品檢出氯霉素，8個(gè)樣品檢出恩諾沙星，9個(gè)樣品檢出氫化可的松，2個(gè)樣品檢出氧氟沙星。選取4個(gè)代表性陽性樣品，采用不同檢測(cè)方法進(jìn)行確證分析，陽性樣品的檢測(cè)結(jié)果見表3和圖3。結(jié)果表明：陽性結(jié)果基本一致，本方法可滿足實(shí)際檢測(cè)需要。

圖3 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）與多寶魚陽性樣品（B）的譜圖Fig.3 Spectra of chloramphenicol standard（A）and a turbot positive sample（B）

表3 不同方法對(duì)陽性樣品檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比Table 3 Comparison of different detection methods for positive samples

3 結(jié) 論

本文建立了可高通量快速篩查水產(chǎn)品中123種藥物殘留的在線凈化/液相色譜－四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)。所建方法的篩查濃度水平能夠滿足水產(chǎn)品中藥物殘留管理要求，有效提高了水產(chǎn)品中獸藥殘留的快速檢測(cè)水平，對(duì)于提高水產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)水平具有重要的意義。