馮潤嬋，袁 萍，譚樹良，毋福海，蘇政權(quán)，白 研，賀錦燦

（廣東藥科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510310）

副溶血性弧菌（Vibr io parah aemol yticus，V.P）是革蘭氏陰性菌，多存在于海水、海產(chǎn)品及鹽漬食品中［1］。誤食V.P污染的海產(chǎn)品容易導(dǎo)致胃腸道疾?。?］，致病率甚至超過鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌等食源性細(xì)菌［3］。由V.P引起的食物中毒事件越來越多，對(duì)食品質(zhì)量安全和人體健康造成了極大威脅。目前，檢測V.P的方法主要有傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法、雙層平板法、酶聯(lián)免疫法、PCR法、實(shí)時(shí)熒光PCR法、雙重PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）、納米材料輔助信號(hào)法等［4－9］。其中平板法操作復(fù)雜、耗時(shí)長，無法實(shí)現(xiàn)V.P的快速檢測［4－5］；免疫法和PCR法操作不當(dāng)易導(dǎo)致假陽性結(jié)果［6－7］；LAMP法對(duì)技術(shù)人員的要求高［8］?；诩{米材料的分析方法具有簡單、快速的優(yōu)點(diǎn)，但靈敏度有限。因此，建立一種快速、靈敏的海產(chǎn)品中V.P的檢測方法具有重要意義。

納米材料與DNA酶放大技術(shù)結(jié)合可顯著提高納米分析方法的靈敏度。例如，Lu等［9］以納米石墨烯為熒光猝滅平臺(tái)，建立了一種核酸酶輔助信號(hào)放大法檢測三磷酸腺苷和可卡因的分析方法，檢出限比未放大的方法低3個(gè)數(shù)量級(jí)。金屬有機(jī)骨架材料（MOFs）［10］是一類由金屬離子（或簇）與有機(jī)配體連接而成的晶體結(jié)構(gòu)的雜化材料，比表面積大，孔隙率高，在分離、催化、生物傳感等領(lǐng)域中具有重要應(yīng)用［11］。特別地，MOFs可通過π－π作用和電荷作用吸附帶負(fù)電的單鏈DNA分子［12］，且過渡金屬離子的開放位點(diǎn)以及有機(jī)配體的共軛π電子系統(tǒng)具有熒光猝滅性質(zhì)，背景信號(hào)低，是理想的納米熒光猝滅材料。核酸適配體（Aptamer）［13］是對(duì)特定靶標(biāo)具有特異性識(shí)別作用的短鏈DNA分子，具有特異性好和親和力高等特點(diǎn)，可以提高方法的選擇性［14－16］。核酸外切酶Ⅰ（ExoⅠ）［17］具有特異性好、敏感性高、操作簡單、反應(yīng)條件簡單、無需依賴特定識(shí)別位點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)，在信號(hào)放大［18］中起關(guān)鍵作用。

本文基于Cu－MOF的熒光猝滅性質(zhì)，適配體的特異性和ExoⅠ的催化水解作用，建立了一種快速、靈敏檢測V.P的適配體熒光法。在室溫下合成Cu－MOF，研究其形貌、結(jié)構(gòu)及熒光猝滅機(jī)理，通過優(yōu)化Cu－MOF的體積、猝滅時(shí)間、ExoⅠ用量及恢復(fù)時(shí)間等分析條件，建立了快速檢測V.P的適配體熒光分析方法，并成功應(yīng)用于實(shí)際水產(chǎn)品中V.P的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F－7000熒光分光光度計(jì)（日本日立有限公司）；FA1204B電子分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；DF－101S磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；H3－18K臺(tái)式高速離心機(jī)（河南可成儀器設(shè)備有限公司）；YC－S30恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；LGJ－10C冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）；Hitachi S－4800掃描電子顯微鏡（日本日立有限公司）；SmartLab X射線衍射儀（日本理學(xué)有限公司）；Zsizer Nano ZS90 zeta電位儀（英國馬爾文公司）。

均苯三甲酸（H3BCT）、醋酸銅（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；V.P（ATCC17802）、沙門氏菌（S.A，ATCC14028）、單增李斯特菌（L.M，ATCC19115）、大腸桿菌（E.coli，ATCC25922）、TCBS瓊脂（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；熒光素標(biāo)記的V.P核酸適配體（3′-FAM-TCTAAAAATGGGCAAA GAAACAGTGACTCGTTGAGATACTAAA-5′［19］）購于生工生物工程（上海）股份有限公司；ExoⅠ（C610019，BBI生命科學(xué)有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為三次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)及計(jì)數(shù)將復(fù)蘇液（3%NaCl堿性蛋白胨水）加入到V.P凍干菌種中混勻，制成菌懸液，于36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用生理鹽水稀釋至不同濃度，參考國標(biāo)測定菌落總數(shù)［20］，用傾注平板法進(jìn)行V.P計(jì)數(shù)，以濁度為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.2.2Cu－MOF的合成量取100 mL 20 mmol/L的H3BCT加入250 mL三頸燒瓶中，一邊攪拌一邊加入等體積、等濃度的醋酸銅溶液，攪拌30 min后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，離心，用乙醇－水溶液（2∶8，體積比）洗滌兩次，通過凍干機(jī)獲得Cu－MOF藍(lán)色凍干粉末。

1.2.3分析方法向微量離心管中依次加入一定體積的Cu－MOF溶液（2.32 mg/mL）、熒光素FAM標(biāo)記的適配體溶液，在渦旋器上振蕩混勻，避光猝滅一定時(shí)間；加入一定濃度的V.P菌懸液、適量ExoⅠ溶液和緩沖溶液，于37℃下孵育一段時(shí)間后，混合液置于熒光分光光度計(jì)中檢測。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組平行3次。

1.2.4樣品處理與分析準(zhǔn)確稱取25 g新鮮蝦肉、八爪魚，分別向其中加入225 mL 3%的NaCl堿性蛋白胨水，采用均質(zhì)器混勻，離心［21］，取上清液，按照“1.2.3”實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析原理

本研究的原理見圖1，Cu－MOF具有熒光猝滅性質(zhì)及保護(hù)適配體不被ExoⅠ水解的作用，當(dāng)熒光分子標(biāo)記的核酸適配體吸附在Cu－MOF上，熒光被猝滅，加入V.P后，核酸適配體與V.P選擇性結(jié)合，脫離Cu－MOF表面，熒光得到一定程度的恢復(fù)。在ExoⅠ的催化作用下，脫離Cu－MOF表面的適配體被水解，釋放出V.P，V.P進(jìn)一步結(jié)合其他吸附在Cu－MOF上的適配體，使水解反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行，熒光信號(hào)進(jìn)一步放大。在一定范圍內(nèi)，V.P濃度與熒光恢復(fù)程度（ΔF）呈線性關(guān)系，據(jù)此建立MOFs材料和酶切放大的適配體熒光法。

圖1 方法的原理圖Fig.1 Schematic illustration of the method

2.2 Cu－MOF的表征

采用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)Cu－MOF的外觀和尺寸進(jìn)行掃描。如圖2A所示，Cu－MOF表面粗糙呈不規(guī)則多面體晶型結(jié)構(gòu)，棱角較為分明，顆粒粒徑約為50～200 nm。采用X射線衍射儀（XRD）對(duì)Cu－MOF進(jìn)行表征，得到的圖譜見圖2B。在11°左右出現(xiàn)特征衍射峰，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［22］，說明Cu－MOF具有較好的結(jié)晶度。

圖2 Cu－MOF的掃描電鏡圖（A）及粉末X射線衍射圖（B）Fig.2 Scanning electron microscope graph（A）and powder－XRD pattern（B）of Cu－MOF

2.3 熒光猝滅機(jī)理的考察

從圖3可以看到，修飾了FAM的適配體溶液在激發(fā)波長490 nm時(shí)，在522 nm處有一最大發(fā)射峰；加入Cu－MOF后，熒光被猝滅；引入V.P后，熒光發(fā)生一定程度的恢復(fù)；加入ExoⅠ后熒光恢復(fù)程度顯著增大。而加入銅鹽溶液或H3BCT溶液后，熒光被大幅度猝滅，引入V.P后，熒光基本不恢復(fù)。加入溶劑（乙醇－水，2∶8），熒光未被猝滅，由此推測熒光猝滅效果主要由Cu（Ⅱ）和H3BCT導(dǎo)致。其中Cu（Ⅱ）的d電子層存在空軌道，這種結(jié)構(gòu)容易發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET），引起熒光猝滅［12］；而H3BCT和FAM分子由于都含有芳香環(huán)，存在n電子，二者共存時(shí)易發(fā)生n－n堆積效應(yīng)，導(dǎo)致熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），從而引起熒光猝滅［13］。

此外，Cu－MOF的Zeta電位為+1.59 mV，適配體的Zeta電位為－2.31 mV，將Cu－MOF和適配體混合后，得到混合溶液的Zeta電位為－0.051 4 mV，說明適配體與Cu－MOF之間發(fā)生了靜電相互作用，因此推測靜電作用是引起熒光猝滅的另一個(gè)原因。

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1Cu－MOF體積的影響當(dāng)Cu－MOF的用量不足時(shí)，熒光無法被完全猝滅，使體系的背景值過高，進(jìn)而降低方法的靈敏度；而Cu－MOF用量過多時(shí)，則會(huì)阻礙V.P與其適配體的特異性結(jié)合。因此，考察了不同體積Cu－MOF（2.32 mg/mL）溶液對(duì)體系的熒光猝滅情況，結(jié)果如圖4A所示。當(dāng)加入體積為90μL時(shí)，熒光猝滅效率最大（達(dá)到92%），繼續(xù)加入Cu－MOF未出現(xiàn)更大的猝滅效率。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇90μL作為Cu－MOF的加入體積。

圖4 Cu－MOF體積對(duì)熒光猝滅效率的影響（A）及酶體積對(duì)熒光恢復(fù)效率的影響（B）Fig.4 Cu－MOF volume on effect of fluorescence quenching efficiency（A），and enzyme volume on effect of fluorescence recovery efficiency（B）

2.4.2猝滅時(shí)間的影響Cu－MOF與適配體結(jié)合需要一定的時(shí)間。若時(shí)間過短，Cu－MOF對(duì)適配體的吸附不充分，導(dǎo)致猝滅不充分，影響背景值；若時(shí)間過長，則Cu－MOF對(duì)適配體吸附過于牢固，后續(xù)加入V.P需更長時(shí)間脫附，不能滿足快速檢測的需求。本文考察了不同猝滅時(shí)間（0、10、20、30、40、50和60 min）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)猝滅時(shí)間為10 min時(shí)，猝滅效率達(dá)到91%，隨著時(shí)間的延長，猝滅效率趨于穩(wěn)定。因此，實(shí)驗(yàn)選擇10 min作為猝滅時(shí)間。

2.4.3ExoⅠ體積的影響為了評(píng)估ExoⅠ輔助信號(hào)放大的效果，考察了ExoⅠ體積對(duì)熒光恢復(fù)的影響，結(jié)果如圖4B所示。當(dāng)ExoⅠ的體積為0時(shí)，熒光恢復(fù)效率為15%，當(dāng)ExoⅠ的體積為4μL時(shí)，熒光恢復(fù)效率達(dá)到48%。由此對(duì)比，后者的信號(hào)放大了3倍左右，且隨著體積增大，信號(hào)趨于穩(wěn)定。因此，實(shí)驗(yàn)選擇4μL ExoⅠ溶液作為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

2.4.4熒光恢復(fù)時(shí)間的影響V.P與適配體結(jié)合需要一定的時(shí)間。時(shí)間過短，結(jié)合不充分，將會(huì)影響方法的重現(xiàn)性；時(shí)間過長，ExoⅠ的酶切效率可能受影響。實(shí)驗(yàn)考察了熒光恢復(fù)時(shí)間（10、20、30、40、50 min）的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)恢復(fù)時(shí)間為20 min時(shí)，熒光恢復(fù)效率最大且趨于穩(wěn)定，30 min后熒光恢復(fù)程度下降。綜合考慮，選擇20 min作為恢復(fù)時(shí)間。

2.4.5加入順序的影響由于Cu－MOF的吸附性較強(qiáng)，可能對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生一定的吸附作用而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)通過篩選試劑的加入順序以降低吸附作用的影響。如圖5所示，加入或未加入ExoⅠ時(shí)，Cu－MOF+V.P+Aptamer的加入順序均比Cu－MOF+Aptamer+V.P的熒光恢復(fù)效率低，說明Cu－MOF對(duì)菌株具有一定的非特異性吸附作用，降低了體系的熒光恢復(fù)效率。值得注意的是，對(duì)于不同加入順序，存在ExoⅠ的體系均比不存在ExoⅠ時(shí)得到的熒光恢復(fù)效率高，且加入ExoⅠ后，兩種不同加入順序得到的熒光恢復(fù)效率的差值（ΔRE）由2.49%降至0.95%，說明ExoⅠ的引入不但放大了熒光信號(hào)，同時(shí)也降低了Cu－MOF對(duì)菌株的非特異性吸附造成的影響。因此，為了減少Cu－MOF對(duì)細(xì)菌的非特異性吸附，提高方法的靈敏度，實(shí)驗(yàn)選擇Cu－MOF+V.P+Aptamer+ExoⅠ作為試劑的加入順序。

圖5 試劑加入順序的影響Fig.5 Effect of the agents’addition order on fluorescence recovery efficiency

2.5 線性范圍與檢出限

根據(jù)上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，在該體系中加入不同濃度的V.P菌懸液，測定熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在8.4×102～2.0×105CFU/mL濃度范圍內(nèi)，V.P濃度的對(duì)數(shù)與熒光恢復(fù)程度（ΔF）呈良好線性關(guān)系，線性方程為ΔF=7.30lgc－19.58（r2=0.998 6），檢出限為37 CFU/mL。同時(shí)比較了不加ExoⅠ的非放大熒光法，得到的線性范圍為4.12×104～8.23×106CFU/mL，檢出限為1.0×104CFU/mL。說明ExoⅠ的加入拓寬了方法的線性范圍，降低了檢出限。

2.6 方法的選擇性

在優(yōu)化條件下，用濃度均為105CFU/mL的V.P、沙門氏菌（S.A）、李斯特菌（L.M）、大腸桿菌（E.coli）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示，只有加入V.P體系的熒光恢復(fù)程度最大，加入其他3種細(xì)菌熒光基本不能恢復(fù)，說明該方法對(duì)V.P具有高選擇性。

圖6 不同細(xì)菌加入該體系后的熒光恢復(fù)情況Fig.6 The value of fluorescence recoveries after adding different bacterias in the system

2.7 實(shí)際樣品的分析

在優(yōu)化條件下，將該方法用于蝦肉和八爪魚樣品中V.P的分析。結(jié)果顯示，蝦肉和八爪魚樣品均未檢出V.P。分別加入6.79×104、6.79×105、6.79×106CFU/mg V.P進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，測得加標(biāo)回收率為88.8%～109%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.7%～6.6%（見表1），說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度較好。

表1 蝦、八爪魚樣品中V.P的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)Table 1 Spiked recoveries of V.P in shrimp meat and octopus samples

3 結(jié) 論

本文建立了一種基于Cu－MOF和酶切放大的適配體熒光法。在8.4×102～2.0×105CFU/mL濃度范圍內(nèi)，V.P濃度的對(duì)數(shù)（lgc）與熒光恢復(fù)程度（ΔF）呈良好線性關(guān)系，線性方程為ΔF=7.30lgc－19.58（r2=0.998 6），檢出限為37 CFU/mL，整個(gè)分析過程不超過30 min。將方法應(yīng)用于蝦、八爪魚樣品的檢測，加標(biāo)回收率為88.8%～109%，RSD為3.7%～6.6%。該方法具有檢測速度快、線性范圍寬、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)實(shí)際食品樣品中V.P的分析具有一定潛力。