吳學(xué)峰，周 熙，黃曉蘭，吳惠勤，謝 斌*

（1.廣東省科學(xué)院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東省中藥質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070；2.廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510623）

廣佛手為蕓香科柑橘屬植物佛手Citr us medicaL.var.sarcod act ylisSwingle的干燥果實，切片曬干可得生廣佛手，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰的功效［1］。廣佛手主產(chǎn)于廣東高要、德慶等地，作為傳統(tǒng)南藥，近年來已被《廣東省嶺南中藥材保護(hù)條例》收錄為第一批受保護(hù)的嶺南中藥材。制廣佛手是嶺南特色飲片，由生廣佛手炮制晾干制得，在廣東地區(qū)的臨床應(yīng)用中，制廣佛手較生廣佛手更為常用。中藥炮制后，化學(xué)成分往往會發(fā)生變化，繼而改變藥材的性味和功效，因此揭示廣佛手炮制前后化學(xué)成分的變化規(guī)律顯得尤為重要。目前，生、制佛手的化學(xué)成分差異研究主要集中在揮發(fā)性成分，如羅朵生等［2］、汪金玉等［3］采用氣相色譜－質(zhì)譜（GC－MS）技術(shù)研究佛手炮制前后的揮發(fā)油成分差異，發(fā)現(xiàn)經(jīng)炮制后，佛手中的飽和化合物含量增加，不飽和化合物含量降低。而難揮發(fā)性成分的變化規(guī)律研究較薄弱，僅汪金玉等［4］研究發(fā)現(xiàn)廣佛手炮制前后5-羥甲基糠醛的含量增加明顯，揭示炮制中發(fā)生了美拉德反應(yīng)，同時橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素的含量也發(fā)生變化。

主成分分析（PCA）與正交偏最小二乘法判別分析（OPLS－DA）等化學(xué)模式識別方法是區(qū)分藥材、篩選中藥差異性成分和尋找化學(xué)標(biāo)志物的重要方法，在中藥質(zhì)量控制、組效關(guān)系研究中具有重要意義［5］。中藥指紋圖譜是中藥真?zhèn)舞b定、質(zhì)量一致性和穩(wěn)定性評價的可行性方法［6－7］。李金玉等［8］收集廣東高要不同收期的20個樣品建立了佛手的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，選定橙皮苷與5，7-二甲氧基香豆素為參考成分，發(fā)現(xiàn)相同采摘期佛手的化學(xué)成分及含量存在差異；鄭振興等［9］用31批佛手建立HPLC指紋圖譜，可用于鑒別佛手真?zhèn)闻c區(qū)分同科同屬植物。但佛手的HPLC指紋圖譜僅提供其化學(xué)成分及色譜峰保留時間信息，缺乏色譜峰的定性數(shù)據(jù)，又因紫外檢測器吸收波長的選擇性，難以較全面表征佛手復(fù)雜的化學(xué)成分。超高效液相色譜－四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（UPLC－Q－TOF MS）具有高靈敏度、高分辨率及強(qiáng)大的定性表征能力，可彌補(bǔ)HPLC的不足，因此采用UPLC－Q－TOF MS建立中藥及中成藥指紋圖譜具有良好的發(fā)展前景。

本研究采用UPLC－Q－TOF MS建立生、制廣佛手的指紋圖譜，所得指紋圖譜不僅反映了廣佛手的難揮發(fā)性化學(xué)組成，還能提供色譜峰的定性數(shù)據(jù)，可較全面地表征生、制廣佛手的化學(xué)成分，并可用于廣佛手真?zhèn)舞b別。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計方法，分析生廣佛手經(jīng)炮制后難揮發(fā)性成分的變化并找出顯著性差異成分，對于揭示其炮制內(nèi)涵和開展生、制廣佛手的質(zhì)量控制具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 試劑與樣品

5，7-二甲基香豆素、佛手苷內(nèi)酯、香葉木苷、香葉木素、諾米林、黃柏酮、6，7-二甲氧基香豆素、棕櫚酸、原兒茶酸、圣草次苷、佛手酚、α-亞麻酸、油酸、橙皮素購于成都瑞芬思生物科技有限公司；水合氧化前胡素購于上海詩丹德生物技術(shù)有限公司；阿魏酸、檸檬苦素、橙皮苷、蘆丁、歐前胡素購于廣州分析測試中心科力技術(shù)開發(fā)公司；壬二酸購于成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司；蘋果酸購于常州新華活性研究所。所有對照品純度均大于98%。

甲醇、乙腈（色譜純）購自德國Merck公司；蒸餾水購自中國香港屈臣氏公司；甲酸（色譜純）購自美國Fisher Scientific公司；乙酸銨（色譜純）購自美國Sigma－Aldrich公司。

11批次生廣佛手產(chǎn)地均為廣東肇慶，其中10批次購自佛山市大瀝鎮(zhèn)黃芪聯(lián)益貿(mào)易部，1批次購自廣州市越秀區(qū)大參林藥房，分別編號為SG1～SG11。稱取各批次生廣佛手約50 g，充分潤濕后用紗布包裹置于蒸鍋中，待水沸騰后轉(zhuǎn)小火，繼續(xù)炮制2.5 h，自然降溫后于50℃恒溫干燥箱中烘干［3］，即得制廣佛手樣品，分別編號為ZG1～ZG11。樣品信息見表1。

表1 廣佛手樣品編號和詳細(xì)信息Table 1 Fingered Citron sample number and details

1.2儀器

1290液相色譜－G6540系列四極桿－飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源（ESI），MassHunter數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（美國安捷倫科技有限公司）；TP－114型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；JP－060超聲波清洗機(jī)（深圳市潔盟七夕設(shè)備有限公司）；H1850R離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；DH9－9071A電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1供試品制備將樣品粉碎后過3號篩（孔徑0.355 mm），精密稱取1.0 g樣品置于50 mL錐形瓶中，加入10 mL無水甲醇，搖勻，稱定重量，超聲1 h后取出，冷卻至室溫。稱定重量并用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，取上層液體以14 000 r/min離心10 min，上清液即為供試品溶液。質(zhì)控樣品（QC）由各樣品各取100μL混合制得。

1.3.2對照品溶液制備分別稱取各對照品適量溶于甲醇，制得質(zhì)量濃度約為1 000 mg/L的單一對照品溶液。臨用前取各對照品儲備液適量并混合，用甲醇稀釋至10 mg/L，即得混合對照品溶液。

1.3.3色譜條件色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC－C18柱（3.0 mm×150 mm×2.7μm）；流動相為：A（0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨水溶液）－B（乙腈）。梯度洗脫程序：0～5 min，95%～90%A；5～10 min，90%～88%A；10～35 min，88%～80%A；35～50 min，80%～70%A；50～65 min，70%～60%A；65～70 min，60%～30%A；70～78 min，30%～10%A；78～81 min，10%～2%A；81～84 min，2%A；84～84.1 min，2%～95%A；84.1～88 min，95%A。流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃；檢測時間：88 min。

1.3.4質(zhì)譜條件毛細(xì)管電壓：3 500 V；噴嘴電壓：1 000 V；毛細(xì)管出口電壓：150 V；錐孔電壓：65 V；干燥氣（氮氣）溫度：300℃；干燥氣（氮氣）流速：8 L/min；鞘氣（氮氣）溫度：350℃；鞘氣（氮氣）流速：12 L/min；碰撞能量梯度：10、20、40 eV，一級質(zhì)譜掃描范圍：m/z100～1 000，二級質(zhì)譜掃描范圍：m/z50～1 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC－Q－TOF MS指紋圖譜的建立

2.1.1方法學(xué)考察指標(biāo)的確定前期研究發(fā)現(xiàn)，負(fù)離子模式下檢出成分較正離子模式多［10］，因此本實驗采用ESI源在負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)。為使建立的指紋圖譜科學(xué)、可靠，選擇色譜響應(yīng)較好且具代表性的活性成分圣草次苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、檸檬苦素和諾米林酸為指標(biāo)，用于指紋圖譜方法學(xué)驗證，驗證內(nèi)容包括精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性。

2.1.2精密度取同一批生廣佛手供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算上述5種選定指標(biāo)的色譜峰保留時間及峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，所有參考指標(biāo)保留時間和峰面積的RSD分別為0.010%～0.21%和0.37%～3.3%。將6次采集數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”軟件（簡稱相似度評價軟件）進(jìn)行相似度評價，結(jié)果均大于0.99。以上結(jié)果表明儀器的精密度良好，符合廣佛手指紋圖譜建立的要求。

2.1.3重復(fù)性稱取6份同一批號的生廣佛手，制備6份平行樣品，依次進(jìn)樣分析，計算選定指標(biāo)對應(yīng)色譜峰保留時間及峰面積的RSD。結(jié)果顯示，所有參考指標(biāo)保留時間和峰面積的RSD分別為0.010%～0.19%和0.93%～4.6%。將6次采集數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似度評價軟件進(jìn)行相似度評價，結(jié)果均大于0.99。以上結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好，符合廣佛手指紋圖譜建立的要求。

2.1.4穩(wěn)定性制備1份樣品溶液，分別在0、2、4、8、12、18、24 h時進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，并計算選定指標(biāo)對應(yīng)色譜峰保留時間及峰面積的RSD。結(jié)果顯示，所有參考指標(biāo)保留時間和峰面積的RSD分別為0.050%～0.17%和3.5%～6.3%。將7次采集數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似度評價軟件進(jìn)行相似度評價，結(jié)果均大于0.99。以上結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好，符合廣佛手指紋圖譜建立的要求。

2.2 生、制廣佛手的化學(xué)成分

按照“1.3.3”與“1.3.4”的色譜與質(zhì)譜條件對標(biāo)準(zhǔn)品溶液、生廣佛手及制廣佛手樣品溶液進(jìn)行分析，其負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖1。通過分子離子峰精確質(zhì)量數(shù)、二級譜圖等信息，結(jié)合文獻(xiàn)［9－11］與化合物數(shù)據(jù)庫，對樣品中37個成分進(jìn)行鑒定，包括：10個黃酮及黃酮苷類、4個香豆素類、12個有機(jī)酸類、5個糖苷類、2個檸檬苦素類及4個其它類（見表2）。其中，圣草次苷可抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及降血脂［12］；檸檬苦素類化合物具有抑制乳腺癌細(xì)胞的潛力［13］；橙皮苷為《中國藥典》規(guī)定的廣佛手指標(biāo)成分［1］，具有抗炎、抗氧化及抗癌功效［14］。

表2 生、制廣佛手化學(xué)成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)及鑒定結(jié)果Table 2 Mass spectrometric data and the identification results of constituents in raw Fingered Citron and processed Fingered Citron

圖1 生廣佛手（A）、制廣佛手（B）甲醇提取物及標(biāo)準(zhǔn)品溶液（C）的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of UPLC－Q－TOF MS for methanol extraction of raw Fingered Citron（A），processed Fingered Citron（B）and standard solution（C）

（續(xù)表2）

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1生廣佛手指紋圖譜的建立利用Qualitative Analysis B.07.00軟件對11批生廣佛手的UPLCQ－TOF MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，提取并積分總離子流（TIC）圖，導(dǎo)出色譜峰峰面積、峰高和保留時間等信息，建立相似度評價軟件識別的.txt格式數(shù)據(jù)文件，導(dǎo)入評價軟件，建立生廣佛手的UPLCQ－TOF MS指紋圖譜（圖2A），并生成對照譜圖（圖2B）。指紋圖譜的相似度結(jié)果均大于0.96，表明11批次生廣佛手的相似度較好。相似度評價軟件自動識別出24個共有峰，通過分子離子峰精確質(zhì)量數(shù)、二級譜圖等信息，結(jié)合文獻(xiàn)、化合物數(shù)據(jù)庫與對照品驗證，鑒定出以下19個成分：S1、S2、S3為1-O-（3-丁烯基）-6-O-α-L-阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷或異構(gòu)體，S6為金圣草素-6，8-葡萄糖苷，S7為圣草次苷，S8為6-（β-D-吡喃葡萄糖氧基）-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸，S9為3-羥基-2-甲氧基-5，6-二甲基-苯甲酸，S10為橙皮苷，S11為水合氧化前胡素，S12為橙皮素，S14為3，5，6-三羥基-3′，4′，7-三甲氧基黃酮或異構(gòu)體，S15為檸檬苦素，S17為諾米林酸，S18為3，5，6-三羥基-4′，7-二甲氧基黃酮或異構(gòu)體，S20為α-亞麻酸，S21為甲氧基-十五烷酸，S22為油酸，S23為棕櫚酸，S24為十八烷酸（見表2）。

圖2 生廣佛手藥材的指紋圖譜（A）與對照指紋圖譜（B）Fig.2 Fingerprint（A）and reference fingerprint（B）of raw Fingered Citron the number denoted were the same as those in Table 2

2.3.2制廣佛手指紋圖譜的建立將11批制廣佛手的UPLC－Q－TOF MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)按照“2.3.1”方法操作，建立制廣佛手的UPLC－Q－TOF MS指紋圖譜（圖3A），生成對照譜圖（圖3B），得到相似度均大于0.96，表明11批次制廣佛手的相似度好。制廣佛手的UPLC－Q－TOF MS指紋圖譜中有22個共有峰，通過裂解規(guī)律推斷、數(shù)據(jù)庫匹配、參考文獻(xiàn)與對照品驗證，鑒定出以下14個成分：Z1為1-O-（3-丁烯基）-6-O-α-L-阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷或異構(gòu)體，Z2為3-甲氧基-4-O-β-D-葡萄糖基苯甲酸乙酯，Z3為圣草次苷，Z4為橙皮苷，Z5為水合氧化前胡素，Z9為3，5，6-三羥基-3′，4′，7-三甲氧基黃酮或異構(gòu)體，Z10為檸檬苦素，Z12為諾米林酸，Z13為3，5，6-三羥基-4′，7-二甲氧基黃酮或異構(gòu)體，Z16為葡萄內(nèi)酯，Z19為α-亞麻酸，Z20為油酸，Z21為棕櫚酸，Z22為十八烷酸（見表2）。

圖3 制廣佛手藥材的指紋圖譜（A）與對照指紋圖譜（B）Fig.3 Fingerprint（A）and reference fingerprint（B）of processed Fingered Citron the number denoted were the same as those in Table 2

生、制廣佛手的UPLC－Q－TOF MS指紋圖譜中，共檢出成分有11個，分別為：1-O-（3-丁烯基）-6-O-α-L-阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷或異構(gòu)體、圣草次苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、3，5，6-三羥基-3′，4′，7-三甲氧基黃酮或異構(gòu)體、檸檬苦素、諾米林酸、α-亞麻酸、油酸、棕櫚酸和十八烷酸。表明廣佛手生品與制品的指紋圖譜較為相似。未同時檢出的成分有7個，分別為：S6（金圣草素-6，8-葡萄糖苷），S8（6-（β-D-吡喃葡萄糖氧基）-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸），S9（3-羥基-2-甲氧基-5，6-二甲基-苯甲酸），S12（橙皮素），S21（甲氧基-十五烷酸），Z2（3-甲氧基-4-O-β-D-葡萄糖基苯甲酸乙酯）以及Z16（葡萄內(nèi)酯），可作為輔助鑒定生、制廣佛手的成分。比較發(fā)現(xiàn)，生廣佛手炮制后金圣草素-6，8-葡萄糖苷、6-（β-D-吡喃葡萄糖氧基）-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸、3-羥基-2-甲氧基-5，6-二甲基-苯甲酸、橙皮素及甲氧基-十五烷酸在制廣佛手中未檢出，而是檢出了3-甲氧基-4-O-β-D-葡萄糖基苯甲酸乙酯與葡萄內(nèi)酯。其中，橙皮素可抑制黑色素瘤增殖，有抗腫瘤作用［11］，表明生廣佛手炮制后的難揮發(fā)性化學(xué)成分發(fā)生變化，繼而改變其功效。

2.4 化學(xué)模式識別分析

主成分分析（PCA）通過對高維數(shù)據(jù)降維，變換出重要的少數(shù)變量來反映整個樣品的信息，可以清晰展示數(shù)據(jù)內(nèi)的重復(fù)性與各組樣本的差異性［14］。正交偏最小二乘法判別分析（OPLS－DA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理時引用了回歸模型，可建立各數(shù)據(jù)與分組的關(guān)系，取得各組樣本間的差異信息，還可對樣本的分組進(jìn)行預(yù)測。上述2種方法均可衡量各種成分表達(dá)模式對各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，從而輔助標(biāo)志成分的篩選［15］。因此，利用UPLC－Q－TOF MS在正、負(fù)模式下采集數(shù)據(jù)，用SIMCA14.1軟件對生、制廣佛手進(jìn)行PCA與OPLS－DA分析，研究廣佛手炮制前后難揮發(fā)性成分的差異性。

2.4.1主成分分析將22批廣佛手的數(shù)據(jù)經(jīng)安捷倫Profinder 10軟件進(jìn)行處理，得到保留時間、精確質(zhì)量數(shù)與響應(yīng)度構(gòu)成的數(shù)據(jù)文件，導(dǎo)入SIMCA14.1軟件，在PCA－X模式下進(jìn)行分析。從得分圖（圖4）看出，質(zhì)控樣（QC）聚集較好，表明方法穩(wěn)定；制廣佛手（Z）與生廣佛手（S）樣品分別沿t（1）或t（2）軸分開，說明廣佛手炮制前后的化學(xué)組成存在差異；購于大參林藥店的生廣佛手與其制品在中心橢圓外，與集中購買的10批次樣品不聚集，說明兩種來源的廣佛手存在差異，也證實了兩者來源不同。

圖4 樣品的PCA-X模式得分圖Fig.4 PCA-X scores of samples

2.4.2正交偏最小二乘法判別分析對生、制廣佛手兩組樣品進(jìn)行OPLS－DA分析，從得分圖（圖5A）可見，生廣佛手與制廣佛手聚類明顯，兩種模式下的Q2（cum）分別為0.966和0.985，表明模型的可預(yù)測準(zhǔn)確程度分別為96.6%與98.5%，模型良好。

圖5 OPLS－DA得分圖（A）與模擬驗證圖（B）Fig.5 OPLS－DA model scores（A）and OPLS－DA model permutations（B）

通過置換檢驗，驗證當(dāng)前參數(shù)下OPLS－DA分析得到的模型是否過擬合。置換次數(shù)為200次的結(jié)果見圖5B，其中虛線為模型所得回歸線，左側(cè)藍(lán)色Q2值均低于右側(cè)的Q2原始值，Q2散點所在回歸線與左側(cè)垂直軸交于零點以下，說明OPLS－DA原始模型有效，未出現(xiàn)過擬合。表明廣佛手制品與其同源生品的化學(xué)成分存在顯著性差異。

根據(jù)變量投影重要性VIP＞1與S-plots圖中p（corr）＞0.58的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異化合物，通過文獻(xiàn)檢索、數(shù)據(jù)庫匹配及裂解規(guī)律，共鑒定出5個顯著性差異成分，分別為：諾米林酸、5-異戊烯氧基-7-甲氧基香豆素、棕櫚酸、油酸和水合氧化前胡素（見表3）。

表3 顯著性差異成分Table 3 Significant difference ingredients

比較發(fā)現(xiàn)，上述成分在廣佛手的生品與制品中均有檢出，但含量存在差異，將它們各自在制品與生品中的峰面積進(jìn)行對比，得到成分含量對比倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C），見表3。由表3可見，廣佛手炮制后，差異性成分的含量普遍增加，5-異戊烯氧基-7-甲氧基香豆素增加最明顯（FC=29.11），其炮制后的含量約提高29倍。研究發(fā)現(xiàn)，5-異戊烯氧基-7-甲氧基香豆素具有在體內(nèi)外抑制腫瘤的活性［16］，水合氧化前胡素（FC=1.34）可抑制細(xì)胞凋亡，具有抗炎功效［17］。因此，推測炮制后廣佛手的抗炎和抑瘤活性強(qiáng)度可能隨著成分含量的變化而改變。

3 結(jié) 論

本研究基于UPLC－Q－TOF MS技術(shù)在正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，根據(jù)分子離子峰精確質(zhì)量數(shù)、二級譜圖等信息，結(jié)合文獻(xiàn)和化合物數(shù)據(jù)庫，并經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品驗證共鑒定了生、制廣佛手中37個化學(xué)成分，首次建立生廣佛手與制廣佛手的UPLC－Q－TOF MS指紋圖譜。其中生廣佛手指紋圖譜有24個共有峰，鑒定出其中19個成分；制廣佛手有22個共有峰，鑒定出其中14個成分。兩種指紋圖譜有11個共檢出成分，說明兩種指紋圖譜存在一定相似性；同時指出可用于輔助區(qū)分兩者的非共檢出的7個成分：金圣草素-6，8-葡萄糖苷、6-（β-D-吡喃葡萄糖氧基）-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸、3-羥基-2-甲氧基-5，6-二甲基-苯甲酸、橙皮素、甲氧基-十五烷酸、3-甲氧基-4-O-β-D-葡萄糖基苯甲酸乙酯、葡萄內(nèi)酯。所建立的指紋圖譜相似度均大于0.96，結(jié)果可靠，可用于廣佛手的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量控制。結(jié)合化學(xué)模式識別方法，鑒定出生、制廣佛手5個含量顯著性差異成分，其中5-異戊烯氧基-7-甲氧基香豆素的FC值增加最為明顯，可作為區(qū)分生、制廣佛手的化學(xué)標(biāo)志物。研究結(jié)果對生、制廣佛手的質(zhì)量控制及藥效學(xué)研究具有一定參考意義。