王藝霞，楊琳燕，黃 迪，李留安，李 娜，張 偉，

郭永澤2*，李 存1*

（1.天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津 300381）

作為一類重要的合成抗菌藥物［1］，喹諾酮類藥物（QNs）由于廣譜抗菌活性被廣泛應(yīng)用于各種疾病和感染的治療［2］。然而，不當(dāng)使用或?yàn)E用QNs會(huì)在蜂蜜中造成獸藥殘留，對(duì)消費(fèi)者產(chǎn)生直接的毒性影響，如過敏反應(yīng)、毒性反應(yīng)和抗藥性。因此，開發(fā)高選擇性和高靈敏度的動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的測(cè)定方法勢(shì)在必行［3－4］。目前的儀器方法如高效液相色譜法（HPLC）［5］、毛細(xì)管電泳法［6－7］和氣相色譜法［8］均能較好滿足獸藥殘留的測(cè)定需求，樣品前處理技術(shù)從而成為制約動(dòng)物源性食品中殘留檢測(cè)發(fā)展的關(guān)鍵［9］。

液相微萃取技術(shù)（LPME）集樣品采集、萃取、富集等過程于一體，具有操作簡(jiǎn)便、富集倍數(shù)高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域的分析檢測(cè)［4，10－11］。與液－液萃取和固相萃取技術(shù)相比，LPME操作簡(jiǎn)單，降低了有毒有機(jī)溶劑的用量［12］。其強(qiáng)大的預(yù)濃縮能力和較短的提取時(shí)間，不僅為儀器檢測(cè)提供了高效、準(zhǔn)確的基礎(chǔ)，也為基質(zhì)復(fù)雜樣品的分析提供了一個(gè)非常有效的處理方案［13］。

為了克服傳統(tǒng)有機(jī)溶劑作為萃取劑的不足，新型綠色的可切換溶劑（SS）逐漸被應(yīng)用于LPME［14］，以減少對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及環(huán)境的危害。SS是可轉(zhuǎn)換親水親油特性的一種特殊液體，在通入或去除CO2的情況下能夠可逆地從一種形式切換到另一種形式［15］。它主要包括可切換親水性溶劑（SHS）和可切換極性溶劑（SPS）。SHS通常由中鏈脂肪酸和叔胺組成，價(jià)格更低，更穩(wěn)定，且與水的混溶性是完全可逆的，因此SHS較SPS更合適作為提取溶劑。基于SHS的液相微萃取方法具有綠色、快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、方便等優(yōu)點(diǎn)［16］。

本文提出了一種注射器內(nèi)完成的基于可切換親水性溶劑的泡騰輔助液相微萃取技術(shù)（EA－LPMESHS），并以可切換親水性溶劑壬酸作為萃取劑進(jìn)行提取及富集。整個(gè)萃取過程均在注射器內(nèi)完成，操作簡(jiǎn)便、省時(shí)，克服了傳統(tǒng)LPME中因萃取相過少而分離困難的缺點(diǎn)。并結(jié)合高效液相色譜－熒光檢測(cè)法（HPLC－FLD）實(shí)現(xiàn)了蜂蜜中麻保沙星、諾氟沙星等7種喹諾酮類藥物的同時(shí)測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

麻保沙星（MAR，99.0%）、諾氟沙星（NOR，99.0%）、環(huán)丙沙星（CIP，92.3%）、洛美沙星（LOM，98.7%）、恩諾沙星（ENR，99.9%）、二氟沙星（DIF，98.0%）、氟甲喹（FLU，99.4%）購于德國Dr.Ehrenstorfer；戊酸、己酸、辛酸、壬酸（純度大于98%，上海麥克林公司）；Na2CO3、H2SO4、NaHCO3、HCl（分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑公司）；庚酸（98%，上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）。

Waters e2695高效液相色譜儀、Waters 2475熒光檢測(cè)器（美國Water公司）。

1.2 色譜條件

色譜柱為Inertsustain C18（4.6 mm×150 mm，5.0μm）；流動(dòng)相：A為0.2%甲酸水溶液，B為乙腈；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10μL；柱溫為（30±5）℃。梯度洗脫條件如下：0～10 min，12%～30%B；10～18 min，30%～60%B；18～19 min，60%～90%B；19～22 min，90%B；22～23 min，90%～12%B；23～30 min，12%B。熒光檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)置如下：0～6.6 min，激發(fā)波長(zhǎng)為297 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為515 nm；6.6～10.5 min，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm；10.5～20 min，激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為365 nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取MAR、NOR、CIP、LOM、ENR、DIF、FLU標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，溶于2.0 mL 0.03%NaOH，充分溶解后用甲醇稀釋定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成100.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。使用時(shí)以甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度，所有溶液儲(chǔ)存于4℃黑暗條件下。

1.4 樣品前處理

從天津市當(dāng)?shù)刭徺I6種不同品牌的蜂蜜樣品，用于實(shí)際樣品檢測(cè)。

稱取2.0 g蜂蜜于50 mL離心管中，添加500 ng/g的QNs，渦旋混勻后加入18 mL 60℃去離子水，渦旋至均一溶液。將所得蜂蜜水溶液（20 mL）于4℃保存，待萃取。

1.5 液相微萃取過程

用移液槍吸取2.0 mL加標(biāo)蜂蜜水溶液于5.0 mL注射器內(nèi)，依次加入200μL壬酸和400μL 2.0 mol/L Na2CO3，混合均勻，溶液呈渾濁狀態(tài)并伴有氣泡，繼續(xù)加入300μL 2.0 mol/L H2SO4，渦旋混勻1.5 min，溶液產(chǎn)生大量氣泡。將注射器倒置幾分鐘，溶液出現(xiàn)分層，上層為萃取相，下層為水相，推動(dòng)注射器將水相排出，保留萃取相，并用冰醋酸定容至2.0 mL，待HPLC－FLD分析。微萃取過程見圖1。

圖1 EA－LPME－SHS方法操作過程Fig.1 Procedure of EA－LPME－SHS approach

2 結(jié)果與討論

采用“一次一個(gè)變量”的原則，改變相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)含有500 ng/g QNs的空白蜂蜜樣品進(jìn)行分析，以確定最佳提取條件（n=3）。

2.1 萃取劑種類的選擇

理想的SHS應(yīng)滿足以下條件：能夠通過調(diào)節(jié)溶液pH值在水混溶狀態(tài)和水不混溶狀態(tài)之間可逆切換；對(duì)疏水形式分析物的溶解性較強(qiáng)；毒性低，沸點(diǎn)高?？疾炝藵M足上述要求的5種中鏈飽和脂肪酸（戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸）作為萃取劑時(shí)對(duì)目標(biāo)分析物萃取效率的影響。提取過程中，5種脂肪酸均具有可切換能力，在pH值高于pKa的條件下能解離成親水形式。結(jié)果顯示，壬酸的提取效果優(yōu)于其他4種脂肪酸，尤其是NOR和CIP的提取回收率明顯高于其他組（見圖2A），這可歸因于其較低的粘度和較高的目標(biāo)分析物溶解度。因此，選擇壬酸作為萃取劑。

圖2 萃取溶劑種類（A）、萃取溶劑體積（B）、pH調(diào)節(jié)劑類型（C）、Na2CO3體積（D）、H2SO4體積（E）及提取時(shí)間（F）的影響Fig.2 Effects of extraction solvent type（A），extraction solvent volume（B），pH regulator type（C），Na2CO3 volume（D），H2SO4 volume（E）and extraction time（F）

2.2 萃取劑體積的優(yōu)化

萃取劑體積是影響提取回收率的重要參數(shù)。向2.0 mL蜂蜜溶液中添加100、150、200、250、300μL的壬酸，考察了萃取劑體積對(duì)目標(biāo)分析物萃取效率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)壬酸體積由100μL增至200μL時(shí)，7種目標(biāo)分析物的提取回收率顯著提高；而壬酸體積繼續(xù)增至300μL時(shí)，目標(biāo)分析物的提取回收率呈下降趨勢(shì)（圖2B）。這可能是由于萃取劑過多帶來的稀釋效應(yīng)導(dǎo)致回收率降低。最終確定萃取劑體積為200μL。

2.3 pH調(diào)節(jié)劑類型的選擇

根據(jù)Shih等［17］報(bào)道，當(dāng)pH值高于其pKa至少3個(gè)pH單位時(shí)，大約99.9%的脂肪酸會(huì)被解離成陰離子形式，并作為一種陰離子表面活性劑存在；相反，當(dāng)pH值低于其pKa至少3個(gè)pH單位時(shí)，99.9%以上的脂肪酸呈中性疏水形式。壬酸的pKa為4.96，可通過添加強(qiáng)堿和強(qiáng)酸改變其疏水和親水性能。此外，二氧化碳的鼓泡有利于增大混合物的接觸面積，從而提高回收率。因此，分別選擇Na2CO3和NaHCO3作為堿性調(diào)節(jié)劑，HCl和H2SO4作為酸性調(diào)節(jié)劑，測(cè)定NaHCO3－HCl、NaHCO3－H2SO4、Na2CO3－HCl和Na2CO3－H2SO44種pH調(diào)節(jié)劑對(duì)萃取效率的影響。由圖2C可見，Na2CO3－H2SO4和Na2CO3－HCl的提取效果優(yōu)于NaHCO3－HCl和NaHCO3－H2SO4，這可能是因?yàn)镹a2CO3的堿性強(qiáng)于NaHCO3，相同用量下，以Na2CO3為堿性調(diào)節(jié)劑時(shí)壬酸的轉(zhuǎn)化率高，對(duì)分析物的提取效率更強(qiáng)。而且NaHCO3的鼓泡能力弱于Na2CO3，這也會(huì)導(dǎo)致萃取效率降低。與Na2CO3－HCl相比，以Na2CO3－H2SO4為pH調(diào)節(jié)劑的提取回收率更高。因此，選擇Na2CO3和H2SO4分別作為堿性和酸性調(diào)節(jié)劑。

2.4 pH調(diào)節(jié)劑體積的優(yōu)化

在Na2CO3存在下，壬酸可轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄孕问?，即轉(zhuǎn)化為陰離子表面活性劑壬酸鈉。Na2CO3溶液的加入量越大，壬酸的轉(zhuǎn)化率越高。因此，考察了不同體積（200、250、300、400、450μL）2.0 mol/L Na2CO3溶液對(duì)目標(biāo)分析物萃取效率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)2.0 mol/L Na2CO3溶液的添加體積增至400μL時(shí)，提取回收率才有明顯提高，而添加體積增至450μL時(shí)，萃取效率降低（見圖2D）。一方面可能是因?yàn)镹a2CO3添加較少，而H2SO4用量不變，溶液pH值過低，使得弱酸性的QNs解離成離子形式而難于富集，導(dǎo)致回收率降低；另一方面，隨著Na2CO3的增加，H2SO4的量不足以使全部壬酸轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷疇顟B(tài)，而導(dǎo)致萃取效率降低。因此，選擇2.0 mol/L Na2CO3的最佳用量為400μL。

H2SO4的加入可使壬酸轉(zhuǎn)變?yōu)樵瓉淼氖杷孕问剑瑥亩鴮?shí)現(xiàn)相分離。考察了不同體積（250、300、350、400、500μL）2.0 mol/L H2SO4溶液對(duì)目標(biāo)分析物萃取效率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)2.0 mol/L H2SO4溶液的添加體積從250μL增至300μL時(shí)，所有QNs（除NOR外）的萃取回收率明顯提高；當(dāng)添加體積超過300μL時(shí)，萃取效率明顯下降（圖2E）。其原因可能是隨著H2SO4體積的增加，溶液pH值逐漸降低，水相中發(fā)生解離的QNs無法富集，導(dǎo)致回收率低。因此，選擇2.0 mol/LH2SO4的最佳用量為300μL。

2.5 提取時(shí)間的優(yōu)化

渦旋可增強(qiáng)分析物在水相與有機(jī)相中的傳質(zhì)作用，加強(qiáng)CO2的鼓泡能力，從而提高萃取效率。考察了不同渦旋時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0 min）對(duì)7種QNs萃取回收率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)渦旋時(shí)間增至1.5 min時(shí)，所有QNs的回收率均達(dá)到最高；而渦旋時(shí)間增至2.0 min時(shí)，所有QNs的回收率降低（圖2F）。理論上，渦旋時(shí)間越長(zhǎng)，萃取效率越高，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著渦旋時(shí)間的增加，一些藥物的結(jié)構(gòu)可能被破壞，導(dǎo)致萃取效率降低。因此，選擇最佳提取時(shí)間為1.5 min。

2.6 方法驗(yàn)證

配制質(zhì)量濃度分別為2.0、5.0、10、50、100、200μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用本方法進(jìn)行測(cè)定，并以7種QNs的峰面積（y）對(duì)其質(zhì)量濃度（x，μg/L）進(jìn)行線性擬合。結(jié)果表明，5種QNs在2.0～200μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（NOR和CIP為2.0～100μg/L）呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.999 5～0.999 9，方法的檢出限（LOD，S/N=3）和定量下限（LOQ，S/N=10）分別為3.0 ng/g和10 ng/g（見表1）。

表1 優(yōu)化條件下7種QNs的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 1 Linear relations，LODs and LOQs of seven QNs under the optimal conditions

采用本方法對(duì)空白蜂蜜樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平（10、100、500 ng/g）的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，重復(fù)進(jìn)樣3次，連續(xù)測(cè)定6 d。結(jié)果表明，7種QNs的回收率為62.8%～117%，日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均不大于6.2%（見表2）。上述結(jié)果表明，該方法的LOD和LOQ較低，具有良好的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和線性。

表2 7種QNs的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of seven QNs

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

為評(píng)價(jià)方法的適用性，在最佳條件下對(duì)6種不同品牌的蜂蜜樣品進(jìn)行檢測(cè)（n=3），所有蜂蜜樣品均未檢出上述7種QNs。選擇3種蜂蜜樣品進(jìn)行100 ng/g QNs的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，得到7種QNs的回收率為78.8%～120%，RSD小于5.1%。圖3分別顯示了在優(yōu)化條件下添加100 ng/g QNs的蜂蜜樣品、10 ng/mL QNs標(biāo)準(zhǔn)溶液以及空白蜂蜜樣品的色譜圖。結(jié)果表明，該方法適用性較好，可用于蜂蜜樣品中QNs的檢測(cè)。

圖3 蜂蜜樣品添加100 ng/g QNs（a）、10 ng/mL QNs標(biāo)準(zhǔn)溶液（b）與空白蜂蜜樣品（c）的色譜圖Fig.3 Chromatograms of real honey sample spiked with 100 ng/g QNs（a），10 ng/mL QNs standard solution（b）and blank honey sample（c）

2.8 與其他方法的比較

將EA－LPME－SHS方法與檢測(cè)QNs的其他文獻(xiàn)方法進(jìn)行了比較（表3）。與其他方法相比，本方法具有萃取劑用量少和提取時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)［5，18－19］。此外，采用可切換親水性溶劑壬酸為萃取劑，對(duì)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)人員友好。該方法是一種綠色、快速、靈敏、簡(jiǎn)便、省時(shí)的前處理方法，可用于蜂蜜樣品中QNs的檢測(cè)。

表3 與其他萃取方法的比較Table 3 Comparison with the previous extraction methods

3 結(jié) 論

本文建立了一種基于注射器內(nèi)的可切換親水性溶劑－泡騰輔助液相微萃取技術(shù)聯(lián)合高效液相色譜－熒光檢測(cè)分析蜂蜜中7種喹諾酮類藥物的方法。通過調(diào)節(jié)pH值改變?nèi)伤岬挠H水性與疏水性，從而對(duì)分析物進(jìn)行提取，整個(gè)提取過程均在注射器中完成，無需離心，克服了萃取相少、分離困難的缺點(diǎn)。該方法具有回收率高、靈敏度好、成本低、重復(fù)性好、操作方便、提取時(shí)間較短和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。