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GSK-3β參與氯化鋰修飾顱內(nèi)感染后癲癇發(fā)作的可能機制

2022-03-23 07:11李志民余巨明蔣國會
重慶醫(yī)學 2022年3期
關鍵詞:小劑量海馬癲癇

李志民,曹 興,余巨明,蔣國會

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,四川南充 637000)

癲癇是一種腦部神經(jīng)元異常放電且反復發(fā)作為特征的常見腦部疾病[1],目前還沒有太多辦法能夠抑制癲癇的發(fā)生。顱內(nèi)感染作為癲癇的重要病因[2],抑制顱內(nèi)感染炎性環(huán)境從而抑制癲癇的發(fā)生無疑是研究的方向。雖然抗感染治療能降低腦炎病死率,但不能改變腦炎后形成癲癇的結果。目前亦推薦預防性抗癲癇治療[3-5]。盡管顱內(nèi)感染是如何導致癲癇發(fā)作和癲癇形成的具體機制迄今還不十分清楚,但推測可能與促炎細胞因子[白細胞介素(IL)-1β、 腫瘤壞死因子(TNF)-α]、抗炎細胞因子(IL-10)失衡,膠質(zhì)細胞異常激活及神經(jīng)元的變性壞死共同導致腦神經(jīng)網(wǎng)絡引起異常興奮有關[6-7]。

糖原合成激酶-3β (GSK-3β)是炎癥TLR4信號通路的關鍵調(diào)節(jié)器,抑制GSK-3β可以達到明顯抗炎作用,而激活GSK-3β則具有明顯促炎作用[8],因而對維持機體炎癥平衡起到至關重要的作用。它作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能并不單一。GSK-3β通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶去磷酸化激活可導致細胞凋亡,然而通過促進絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶磷酸化(P -GSK-3β)而達到細胞保護的作用,均通過pI3K/Akt通路影響GSK-3β的活性[9]。Wortmannin(WT)抑制pI3K使絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶去磷酸化而激活[10],因此被視為GSK-3β的激動劑。氯化鋰(LiCl)和丙戊酸(VPA)能使GSK-3β磷酸化失活,故被視為GSK-3β的抑制劑。LiCl在精神疾病中發(fā)揮了重要作用,目前研究其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦和脊髓損傷[11]及神經(jīng)變性疾病如帕金森病[12]的治療也發(fā)揮一定作用。然而,LiCl對大鼠顱內(nèi)感染及顱內(nèi)感染后癲癇發(fā)作的影響還鮮見報道。本實驗發(fā)現(xiàn)LiCl對癲癇發(fā)作的影響可能與劑量相關,小劑量LiCl(小于40 mg/kg)可能抑制癲癇發(fā)作,而大劑量LiCl(大于60 mg/kg)可促進癲癇的發(fā)作[13]。本課題組前期實驗得出LiCl對大鼠顱內(nèi)感染后癲癇發(fā)作的影響具有劑量依賴效應,但具體機制尚不清楚。因此本研究采用不同水平的LiCl、VPA及WT干預顱內(nèi)感染模型大鼠,通過免疫組織化學、Western blot、ELISA、電生理檢測的方法,探討GSK-3β在LiCl影響顱內(nèi)感染大鼠癲癇發(fā)作的關系,進而為顱內(nèi)感染后癲癇的預防提供方向。

1 材料與方法

1.1 一般材料

選取8~10周齡約200 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠(均由川北醫(yī)學院實驗動物中心提供);LiCl、LPS(美國Sigma 公司)、小膠質(zhì)細胞抗體 (IBA-1,日本W(wǎng)ako 公司)、毛果蕓香堿(Pilo,美國Sigma公司)、Wortmannin (美國Abmole公司)、抗-Phospho-GSK-3α/β抗體、抗-GSK-3α/β抗體(美國R&D公司)、IL-10、IL-1β、TNF-α檢測試劑盒(武漢博士德公司)、神經(jīng)元特異性核蛋白抗體(NeuN,美國Millipore公司)、β-actin多克隆抗體(北京中杉金橋公司)。川北醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準該實驗。

1.2 方法

1.2.1模型制備及分組

制備脂多糖(LPS)顱內(nèi)感染大鼠模型[14]:在大鼠側腦室 (前囟后0.8 mm,旁開1.3 mm,入腦 3.5 mm) 采用注射LPS 50 μg,建立大鼠顱內(nèi)感染模型。對照組(5只)給予側腦室注射同體積生理鹽水5 mL/kg。觀察記錄實驗鼠行為活動,并于24 h檢測實驗鼠海馬組織中炎癥因子和GSK-3β的水平。

側腦室注射LPS誘導顱內(nèi)感染大鼠105只,然后將其均分為LPS組,LPS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組,以及LPS-VPA組和LPS-WT組。對應分組分別進行腹腔注射生理鹽水5 mL/kg,LiCl 10、20、40、80 mg/kg,以及VPA 30 mg/kg和WT 0.6μg/kg[15],LiCl<40 mg/kg時為LPS-小劑量LiCl組。每24小時1次,連續(xù)3 d。

1.2.2癲癇大鼠模型造模及其電生理檢測[16]

根據(jù)3.3 mL/kg的比例,采用水平為10%水合氯醛對大鼠進行腹腔注射麻醉,然后將其置于腦立體定位注射儀上。乙醇消毒后對大鼠進行備皮,沿顱骨中縫剪開頭皮后以Bregma十字縫為參照向左移2.6 mm,向后移3.6 mm為中點用顱骨鉆開一邊長為3 mm骨窗。在骨窗近鼻端鉆2小孔并插入固定小螺栓用于連接參考電極。參照大鼠腦圖譜,以Bregma十字縫為參照向后3.6 mm,向左2.6 mm移動 4×4微陣列排列的16導微絲電極至左側海馬CA1區(qū)并用微推進器向下刺入腦中3.5 mm,然后連接相應電極。待大鼠麻醉蘇醒后,使用16導在體電生理記錄儀(美國Plexon公司)和OmniPlex?D神經(jīng)信號采集系統(tǒng)(美國Plexon公司)記錄大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的電活動信號。首先,采集15 min大鼠清醒狀態(tài)下的腦電信號作為基準線;然后按照360 mL/kg的劑量腹腔注射毛果蕓香堿誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)并記錄30 min。采用腦電分析系統(tǒng)(NeuroExplorer?v4.0)對實驗大鼠腦電信號進行ripples振蕩和SE海馬局部場電位的FRs的功率譜密度均值。

1.2.3IL-1β、TNF-α和IL-10水平檢測

用水合氯醛(3.3 mL/kg,腹腔注射)麻醉大鼠后斷頭取腦,快速分離雙側海馬組織(冰上操作)迅速放入勻漿管制作勻漿,而后將勻漿液移入離心管,于4 ℃、 12 000 r/min離心15 min。取上清液,用Bradford 法測定蛋白水平后分裝于0.5 mL離心管。根據(jù)ELISA試劑盒說明書進行IL-1β、TNF-α和IL-10檢測。

1.2.4p-GSK-3β和GSK-3β水平檢測[16]

采用Western blot對p-GSK-3β和GSK-3β兩個靶蛋白進行定量分析。將實驗大鼠海馬區(qū)提取的蛋白質(zhì)裂解液用10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。然后,采用半干式轉印法將蛋白質(zhì)條帶轉移至硝酸纖維素薄膜上。檢測條件:5%脫脂牛奶,室溫封閉硝酸纖維素薄膜2 h;然后,將封閉液更換為一抗溶液,分別為1∶1 000稀釋的兔抗鼠的p-GSK-3β多克隆抗體溶液、GSK-3β多克隆抗體溶液和β-actin多克隆抗體溶液,4 ℃冰箱孵育過夜。次日,回收一抗溶液,并用PBS洗滌硝酸纖維素薄膜3次,每次5 min。然后,室溫用HRP標記的羊抗兔IgG孵育1.5 h。PBS洗滌硝酸纖維素薄膜3次后,用新鮮配制的化學發(fā)光顯色劑對蛋白質(zhì)條帶進行顯影。用Image J軟件測定各蛋白質(zhì)條帶的灰度值,以靶蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值之比表示靶蛋白的相對表達水平。

1.2.5神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞檢測

采用水平為10%的水合氯醛,按照3.3 mL/kg的劑量,對大鼠實施腹腔注射麻醉。將小鼠固定后用生理鹽水灌流大鼠洗滌血細胞。待右心耳流出液呈無色后再用4%多聚甲醛灌流大鼠。大鼠灌流完成后小心取出腦組織并置于4%多聚甲醛溶液中后固定24 h。將后固定好的腦組織經(jīng)脫水處理后,用石蠟包埋并制作連續(xù)的冠狀組織切片(每片4 μm厚)。海馬區(qū)腦組織切片每間隔4張取1張進行免疫組織化學染色。使用小膠質(zhì)細胞特異性抗體IBA-1(1∶200)檢測活化的小膠質(zhì)細胞;用神經(jīng)元特異性抗體NeuN(1∶1 000)檢測神經(jīng)元細胞。所有組織切片均用蘇木精進行復染。

參照YANG等[17]的方法,對免疫組織化學染色的腦組織切片進行陽性細胞計數(shù)。在40倍放大的顯微鏡視野下,選取海馬CA1及鄰近皮質(zhì)區(qū)中具有代表性的,非重疊區(qū)域(400 μm×400 μm)進行NeuN+和IBA-1+細胞計數(shù)。所有的細胞計數(shù)區(qū)域均由觀察者預先設定,并采用Image-Pro Plus Media Cybernetics系統(tǒng)對NeuN+和IBA-1+細胞自動計數(shù)。計數(shù)視野中,只有形態(tài)結構完整,細胞清晰可辨的NeuN+和IBA-1+細胞才會被計數(shù)。由于大鼠左、右大腦半球的細胞數(shù)目無明顯差別,故不特意區(qū)分左、右半球,并將Image-Pro Plus Media Cybernetics系統(tǒng)獲得的結果用于統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 顱內(nèi)感染大鼠模型中海馬GSK-3β和p-GSK-3β的變化

2.1.1LPS顱內(nèi)感染大鼠模型

相比對照組大鼠而言,LPS組活動明顯減少、食物攝入量降低、飲水量增加、體溫上升明顯。在LPS組的海馬組織中存在明顯的促炎性細胞因子IL-1β和TNF-α的水平增高,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。

a:P<0.05,與對照組比較。

2.1.2大鼠海馬組織中GSK-3β和p-GSK-3β的表達

Western blot分析表明LPS組的大鼠海馬組織中GSK-3β水平較對照組升高(P<0.05),而p-GSK-3β水平卻明顯比對照組降低,見圖2。

2.2 不同干預對顱內(nèi)感染模型大鼠各種檢測指標的影響

2.2.1炎性因子在不同干預處理組中的表達

與LPS組相比LPS-小劑量LiCl組及LPS-VPA組的海馬組織中IL-10的表達水平明顯升高(P<0.05)。LPS-80 mg/kg LiCl組和LPS-WT組的海馬組織中IL-10的表達水平明顯降低(P<0.05),見圖3A。LPS-小劑量LiCl組、LPS-VPA組的海馬組織中IL-1β和TNF-α的表達水平明顯降低(P<0.05),LPS-80 mg/kg LiCl組及LPS-WT組的海馬組織中IL-1β和TNF-α的表達水平明顯升高(P<0.05),見圖3B、C。

A:Western blot檢測;B:GSK-3β相對表達水平;C:p-GSK-3β相對表達水平;a:P<0.05,與對照組比較。

A:IL-10;B:TNF-α;C:IL-1β;1:LPS組;2~5:分別為LPS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組;6:LPS-VPA組;7:LPS-WT組;a:P<0.05,與LPS組比較。

2.2.2不同干預對顱內(nèi)感染大鼠模型海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的影響

LPS-小劑量LiCl組和LPS-VPA組的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結構比LPS組的更為完整,排列也更整齊而致密、細胞核脫失少、染色較深。小劑量LiCl干預組和LPS-VPA組的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量與LPS組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。LPS-80 mg/kg LiCl組及LPS-WT組的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結構的損壞比LPS組更為嚴重,神經(jīng)元排列松散、散亂,細胞核脫失嚴重、著色較淺。海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量與LPS-80 mg/kg LiCl組、LPS-WT組和LPS組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖4、5。

2.2.3不同干預對顱內(nèi)感染大鼠模型海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細胞的影響

LPS-小劑量LiCl組和LPS-VPA組的海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細胞的激活比LPS明顯要少(P<0.05);而LPS-80 mg/kg LiCl組和LPS-WT組的海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細胞的激活比LPS組顯著增多(P<0.05),見圖6、7。

1:LPS組;2~5:分別為LPS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組;5:LPS-VPA組;6:LPS-WT組;a:P<0.05,與LPS組比較。

A:LPS組;B~E:分別為LPS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組;F:LPS-WT組;G:LPS-VPA組。

A:LPS組;B~E:分別為LPS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組;F:LPS-WT組;G:LPS-VPA組。

1:LPS組;2~5:分別為LPS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組;6:LPS-VPA組;7:LPS-WT組;a:P<0.05,與LPS組比較。

2.2.4不同干預對顱內(nèi)感染模型大鼠癲癇發(fā)作的影響

比較各干預組和LPS組的基礎腦電信號、癇性首次發(fā)作和SE潛伏期、SE期的局部場電位變化。(1)不同干預對海馬局部場電位ripples振蕩功率的影響:LPS-小劑量LiCl組和LPS-VPA組的海馬CA1區(qū)的ripples振蕩功率與LPS組相比,明顯降低(P<0.05)。LPS-80 mg/kg LiCl組和LPS-WT組的海馬CA1區(qū)的ripples振蕩功率與LPS組相比,顯著升高(P<0.05),見圖8。(2)不同干預對顱內(nèi)感染模型大鼠SE潛伏期的影響:LPS-小劑量LiCl組和LPS-VPA組的SE潛伏期與LPS組相比明顯延長(P<0.05),LPS-80 mg/kg LiCl組和LPS-WT組的SE潛伏期與LPS組相比明顯縮短(P<0.05)。LPS-小劑量LiCl組和LPS-VPA組的癲癇發(fā)作頻譜能量與LPS組相比明顯降低(P<0.05),LPS-80 mg/kg LiCl組和LPS-WT組的癲癇發(fā)作頻譜能量與LPS對照組相比顯著升高(P<0.05),見圖9、10。(3)不同干預對顱內(nèi)感染模型大鼠SE期FRs的功率譜密度均值的影響:LPS-小劑量LiCl組和LPS-VPA組的海馬區(qū)SE期FRs的功率譜密度均值與LPS組相比明顯降低(P<0.05),LPS-80 mg/kg LiCl干預組和LPS-WT組的海馬區(qū)SE期FRs的功率譜密度均值與LPS組相比明顯升高(P<0.05),見圖11、12。

2.2.5不同干預對顱內(nèi)感染模型大鼠海馬組織中GSK-3β和p-GSK-3β的影響

Western blot分析顯示,LPS-小劑量LiCl組和LPS-VPA組海馬組織中GSK-3β/p-GSK-3β的比值與LPS組相比明顯變小(P<0.05)。LPS-80 mg/kg LiCl組和LPS-WT組海馬組織中GSK-3β/p-GSK-3β的比值與LPS組相比明顯增大(P<0.05),見圖13。

1:LPS組;2~5:分別為LPS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組;6:LPS- VPA組;7:LPS-WT組;a:P<0.05,與LPS組比較。

A:LPS組;B~E:分別為LPS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組;F:LPS-WT組;G:LPS-VPA組。深紅色箭頭指示了腹腔注射毛果蕓香堿的起始時間,黑色箭頭指示了模型大鼠進入SE的起始時間。癲癇發(fā)作頻譜圖的橫坐標代表時間(s),縱坐標代表癲癇發(fā)作頻率(Hz),左側彩色條帶為頻譜能量示例,頻譜能量較高的以紅色表示,頻譜能量較低的則以藍色表示。

1:LPS組;2~5:分別為LPS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組;6:LPS-VPA組;7:LPS-WT組;a:P<0.05,與LPS組比較。

1:LPS組;2~5:分別為LPS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組;6:LPS- VPA組;7:LPS-WT組;a:P<0.05,與LPS組比較。

A:LPS組;B~E:分別為LPS-10、20、40、80 mg/kg LiCl干預組;F:LPS-WT組;G:LPS-VPA組。

1:LPS組;2~5:分別為LPS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組;6:LPS-VPA組;7:LPS-WT組;a:P<0.05,與LPS組比較。

3 討 論

本實驗采用不同劑量的LiCl干預顱內(nèi)感染大鼠,電生理研究結果海馬局部場電位(LFPs)顯示小劑量LiCl干預后延長了毛果蕓香堿誘發(fā)顱內(nèi)感染大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期,降低了SE期的快速高頻振蕩(FRs)功率譜密度均值,大劑量LiCl干預后則結果相反,由此得出小劑量LiCl降低了顱內(nèi)感染后癲癇發(fā)作的易感性及減輕癲癇發(fā)作程度,LiCl對大鼠顱內(nèi)感染后癲癇發(fā)作差異性影響的機制目前尚不十分清楚。盡管有證據(jù)表明感染所致的血腦屏障通透性增加、膠質(zhì)細胞活化增殖、炎性介質(zhì)大量釋放、神經(jīng)元興奮性改變及變性壞死等一系列病理生理改變,均可能參與了顱內(nèi)感染后癇性發(fā)作和癲癇形成的過程[11-13]。本實驗也得出小劑量LiCl干預后減少了顱內(nèi)感染大鼠海馬小膠質(zhì)細胞的活化,降低了海馬促炎細胞因子IL-1β、TNF-α水平,增加了抗炎細胞因子IL-10水平,減輕了海馬神經(jīng)元的變性壞死。而大劑量LiCl干預后則結果相反。

本研究首先確定大鼠側腦室注射LPS 24 h后,大鼠活動明顯減少、食物攝入量降低、飲水量增加、體溫上升明顯,且海馬促炎細胞因子顯著增高,表明成功誘導大鼠顱內(nèi)感染,并發(fā)現(xiàn)大鼠感染后腦內(nèi)海馬GSK-3β水平有升高及p-GSK-3β水平降低變化,因此推測大鼠顱內(nèi)炎癥嚴重程度可能與GSK-3β的活性有關。在LPS致大鼠顱內(nèi)感染的基礎上,采用GSK-3β間接抑制劑VPA(30 mg/kg)和GSK-3β激動劑WT(0.6 μg/kg)分別干預顱內(nèi)感染模型大鼠后,Western blot結果顯示VPA與小劑量LiCl干預后均使顱內(nèi)感染大鼠海馬中p-GSK-3β/GSK-3β比值明顯變大(P<0.05),WT、與大劑量LiCl干預后均使顱內(nèi)感染大鼠海馬p-GSK-3β/GSK-3β比值明顯變小(P<0.05),p-GSK-3β與GSK-3β 的比值大小體現(xiàn)GSK-3β活性的高低。因此VPA與小劑量LiCl干預后抑制了顱內(nèi)感染模型大鼠海馬GSK-3β活性,WT、與大劑量LiCl干預后則增加了顱內(nèi)感染模型大鼠海馬GSK-3β活性。研究證實抑制GSK-3β可有效減輕外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥[18],而激活GSK-3β可間接誘導IL-6、TNF-α的產(chǎn)生來促進CD11b表達而加重炎癥[19]。本實驗結果小劑量LiCl與VPA減少了海馬CA1小膠質(zhì)細胞的激活,同時海馬促炎細胞因子IL-1β、TNF-α分泌減少,抗炎細胞因子IL-10分泌增加,而大劑量LiCl與WT干預后則得出相反的結果,YU等[20]發(fā)現(xiàn)LiCl通過促進GSK-3β的磷酸化而抑制GSK-3β的活性來實現(xiàn)抑制神經(jīng)炎癥作用。本實驗表明LiCl對顱內(nèi)炎癥影響的差異可能是通過調(diào)節(jié)GSK-3β的活性來實現(xiàn)的。

LiCl和VPA作為膜穩(wěn)定劑,對多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有抗炎及神經(jīng)保護作用,LiCl通過調(diào)節(jié)GSK-3β的活性來直接影響顱內(nèi)感染后癲癇的發(fā)作,還是通過調(diào)節(jié)GSK-3β的活性來調(diào)控顱內(nèi)炎癥從而間接影響顱內(nèi)感染后癲癇的發(fā)作,目前尚不清楚。但LiCl在其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中發(fā)現(xiàn),LiCl主要通過抑制GSK-3β的活性來發(fā)揮神經(jīng)保護。眾多研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)GSK-3β途徑亦發(fā)揮神經(jīng)保護作用[21-22]。本實驗和其他研究均發(fā)現(xiàn)LPS誘發(fā)顱內(nèi)感染大鼠的海馬總GSK-3β水平增加[23]。LPS誘發(fā)顱內(nèi)感染大鼠癲癇發(fā)作的敏感性顯著增加。推測GSK-3β可能與癲癇發(fā)作的敏感性有關。本實驗發(fā)現(xiàn)小劑量LiCl與VPA干預后明顯延長了顱內(nèi)感染后SE潛伏期,而大劑量LiCl與WT干預后明顯縮短了顱內(nèi)感染后SE潛伏期,這種結果可能與LiCl參與調(diào)節(jié)GSK-3β的活性有關。研究表明毛果蕓香堿誘導癲癇發(fā)作后海馬的GSK-3β的水平增加,因此GSK-3β與癲癇的發(fā)作可能直接相關[24]。 本研究利用的GSK-3β抑制劑VPA干預,結果與小劑量LiCl干預相同,均降低了癇性發(fā)作的敏感性。而利用GSK-3β的激動劑,結果與小劑量LiCl干預結果相反,與大劑量LiCl干預結果相同,增加了癇性發(fā)作的敏感性。本實驗結果顯示LPS誘發(fā)的顱內(nèi)感染大鼠海馬的GSK-3β水平增高,p-GSK-3β的水平降低。GREEN等[23]用LPS刺激體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞和小膠細胞發(fā)現(xiàn)細胞GSK-3β水平較未刺激組明顯增加,而p-GSK-3β水平較未刺激組明顯減少,因而證明了炎癥提高了GSK-3β的表達活性,同樣用LiCl和LPS同時干預發(fā)現(xiàn)LPS-LiCl組較LPS組GSK-3β的表達活性明顯降低,而p-GSK-3β的表達活性相反,表明GSK-3β與炎癥直接相關。然而在紅藻氨酸誘導癲癇模型的研究中敲出多巴胺D2受體(D2R)基因的小鼠,意外發(fā)現(xiàn)其海馬中 GSK-3β顯著活化,增加了紅藻氨酸對小鼠的興奮毒性,促進了海馬神經(jīng)元的凋亡,增加了小鼠對紅藻氨酸誘發(fā)癲癇的敏感性;然而使GSK-3β磷酸化后,明顯減輕了紅藻氨酸對海馬神經(jīng)元興奮毒性,減少了海馬細胞的凋亡和壞死[25]。提示GSK-3β通過影響海馬神經(jīng)元興奮毒性及變性壞死導致癲癇發(fā)作。然而本研究發(fā)現(xiàn)小劑量LiCl和VPA干預后海馬局部場電位功率譜密度值ripples振蕩功率譜較LPS組明顯降低,且海馬神經(jīng)元凋亡和壞死較少,而大劑量LiCl和WT干預則出現(xiàn)相反的結果。海馬局部場電位ripples振蕩功率譜可能與癲癇發(fā)作相關[26],其功率譜密度值的高低則代表作海馬神經(jīng)元的興奮性。因此小劑量LiCl降低了顱內(nèi)感染大鼠海馬神經(jīng)元興奮性,而大劑量LiCl和WT則作用相反。似乎也驗證了通過調(diào)節(jié)GSK-3β活性而影響神經(jīng)網(wǎng)絡的興奮性。雖然有報道紅藻氨酸誘發(fā)癲癇24 h后海馬中的GSK-3β的活化明顯[27]。但也有報道稱顳葉癲癇患者海馬組織中的p-GSK-3β明顯高于沒有癲癇的患者,但GSK-3β水平輕微增高[28]。GSK-3β僅是WNT信號通路的一部分,有研究發(fā)現(xiàn)癲癇后GSK-3β的活化改變可獨立于WNT途徑[25];也有學者認為GSK-3β是通過多因素多途徑共同作用于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸釋放影響癲癇發(fā)作[28]。近年研究發(fā)現(xiàn)洛伐他汀通過抑制GSK-3β的活性,成功的減少了癲癇大鼠海馬齒狀回(DG)苔蘚纖維發(fā)芽(MFS)[24],DG中的MFS是反復自發(fā)性發(fā)作的發(fā)作頻率和顳葉癲癇的嚴重性高度相關的重要指標[29-31]。因此抑制GSK-3β的活性可以減輕癲癇的發(fā)作程度和腦損傷。已有研究報道FRs可作為癲癇發(fā)作的嚴重程度的標志[32-34],且與神經(jīng)元變性丟失相關[35]。本實驗發(fā)現(xiàn)LPS-小劑量LiCl組及LPS-VPA組SE期FRs的功率譜密度均值較LPS組比較明顯降低(P<0.05),因此可以得出小劑量LiCl及VPA減輕了顱內(nèi)感染模型大鼠的癲癇發(fā)作程度和神經(jīng)元的變性丟失。因此GSK-3β并非直接影響LiCl對顱內(nèi)感染后癲癇的發(fā)作。而是小劑量LiCl抑制顱內(nèi)感染大鼠海馬組織中GSK-3β的表達,抑制炎癥因子,減輕組織病理損傷,延長腦炎后癲癇放電潛伏期,降低海馬神經(jīng)元興奮性,提高癲癇發(fā)作閾值,降低腦炎后癲癇發(fā)作的敏感性,減輕癲癇發(fā)作程度;大劑量LiCl則結果相反。提示GSK-3β可能參與LiCl修飾顱內(nèi)感染后癲癇發(fā)作的機制。

綜上所述,LiCl可能通過影響GSK-3β活性,從而影響膠質(zhì)細胞的活化和炎性細胞因子的分泌,進一步影響神經(jīng)元的變性,最后影響神經(jīng)元的異常放電,達到影響顱內(nèi)感染后癲癇的發(fā)作。因此調(diào)控GSK-3β的活性可望成為改善顱內(nèi)感染后癲癇的發(fā)作治療靶點。

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