姚浩旗，汪惠文，王公孝，楊天德，陳 建

(1.聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院麻醉科,蘭州 730050；2.重慶醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院麻醉科 401120；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系，重慶400038)

右美托咪定(DEX)是高選擇性的α2 受體激動劑[1]，近期研究發(fā)現(xiàn)其有減輕器官缺血再灌注損傷的作用[2-3]。而本課題組前期實驗研究發(fā)現(xiàn)DEX預(yù)處理可以減輕人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Huvecs)在氧糖剝奪再復(fù)氧條件下的損傷[4]，但具體的細胞內(nèi)分子機制還有待于進一步深究。為此本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上探究DEX預(yù)處理對Huvecs的保護機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細胞株Huvecs(由陸軍軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系贈)復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。當(dāng)細胞約80%融合時，用0.05%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.2 試劑藥物

DEX：江蘇恒瑞制藥有限公司；高糖培養(yǎng)基 (DMEM)、胎牛血清：美國Gibico公司；α2 受體激動劑抑制劑育亨賓(YHB)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；山羊抗兔IgG：上海碧云天生物科技公司。β-actin：上海貝博生物，BB-2101;AMP依賴的蛋白激酶α(AMPKα)、磷酸化AMPKα(p-AMPKα)一抗：德國CST公司。Seahorse能量分析試驗材料：海馬生物科技有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Themofisher Scientific公司)；Seahorse細胞能量代謝實時測定儀(美國Agilent公司)；電泳儀、全自動酶標儀化學(xué)發(fā)光曝光儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4 分組

取對數(shù)生長期的細胞消化后接種于直徑3.5 cm培養(yǎng)皿或 Seahorse檢測板中培養(yǎng)。實驗分2部分，氧糖剝奪前細胞分3組：對照組(NC組)、DEX組、DEX+YHB組。DEX+YHB組加入50 μmol/L的DEX和100 μmol/L YHB處理細胞2 h，DEX組加入50 μmol/L的DEX處理細胞2 h。氧糖剝奪再復(fù)氧后細胞分4組：對照組(NC組)、ogd/r組、DEX+ogd/r組、DEX+YHB+ogd/r組。DEX+ogd/r組加入50 μmol/L的DEX預(yù)處理2 h，DEX+YHB+ogd/r組加入50 μmol/L的DEX和100 μmol/L YHB處理2 h，ogd/r組加入等體積的PBS，隨后將3組細胞置于Hank′s液中于缺氧恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，之后換正常培養(yǎng)基置于常氧恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，NC組置于正常條件下培養(yǎng)18 h。

1.5 Western blot檢測氧糖剝奪再復(fù)氧處理前、后各組AMPKα磷酸化水平

每組設(shè)置3個復(fù)孔，將對數(shù)生長期細胞接種于直徑3.5 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，實驗處理后提取各組細胞蛋白進行Western blot檢測。

1.6 細胞線粒體呼吸功能的Seahorse檢測

每組設(shè)置5個復(fù)孔，將對數(shù)生長期的細胞用胰蛋白酶消化后，接種于Seahorse檢測板中，進行線粒體呼吸功能檢測，具體方法參考胡洸瑜等[5]研究。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 DEX提高常氧條件下Huvecs AMPKα磷酸化水平

用Western blot檢測氧糖剝奪前Huvecs p-AMPKα水平。與NC組相比，DEX組AMPKα磷酸化水平升高(NC組：2.762 5±0.929 0；DEX組：4.542 6±0.718 5；n=3，P<0.05)；與DEX組相比，DEX+YHB組AMPKα磷酸水平降低(DEX組：4.542 6±0.718 5；DEX+YHB組：2.827 7±0.054 5；n=3，P<0.05)，見圖1。

圖1 DEX提高常氧條件下Huvecs AMPKα磷酸化水平

2.2 DEX預(yù)處理提高Huvecs常氧條件下線粒體呼吸功能

通過Seahorse 實驗檢測各處理組線粒體的呼吸能力。與NC組相比，DEX組線粒體基礎(chǔ)氧氣消耗速率、三磷酸腺苷(ATP)生成水平和最大氧氣消耗速率升高(NC組：60.770 2±11.393 8、36.806 8±6.127 1、95.914 3±17.298 9；DEX組：78.780 7±19.516 3、48.533 1±14.164 3、128.474 5±9.469 5；n=5，P<0.05)；與DEX組相比，DEX+YHB組Huvecs線粒體基礎(chǔ)氧氣消耗速率、ATP生成水平和最大氧氣消耗速率均下降(DEX組：78.780 7±19.516 3、48.533 1±14.164 3、128.474 5±9.469 5；DEX+YHB組：72.629 6±8.288 1、42.727 9±10.884 8、114.085 0±10.886 5；n=5，P<0.05)，見圖2～4。

圖2 DEX預(yù)處理提高Huvecs的最大呼吸速率

圖3 DEX預(yù)處理提高Huvecs的基礎(chǔ)呼吸速率

2.3 各組AMPKα分子的磷酸化水平

與NC組相比，12 h的氧糖剝奪，4 h的再復(fù)氧可以使Huvecs內(nèi)部p-AMPKα水平升高(NC組：10.503 9±2.479 6，ogd/r組：16.216 9±0.883 2，n=3，P<0.05)；與ogd/r組相比，DEX+ogd/r組AMPKα水平顯著升高(ogd/r組：16.216 9±0.883 2，DEX+ogd/r組：33.435 7±8.866 6，n=3，P<0.05)；與DEX+ogd/r組相比，DEX+YHB+ogd/r組p-AMPKα水平降低(DEX+ogd/r組：33.435 7±8.866 6，DEX+YHB+ogd/r組：21.729 6±7.406 5，n=3，P<0.05)，見圖5。

圖4 DEX預(yù)處理提高Huvecs ATP的生成水平

圖5 DEX提高氧糖剝奪再復(fù)氧條件下Huvecs AMPKα 磷酸化水平

3 討 論

目前的研究證實DEX預(yù)處理對Huvecs具有保護作用[4]，而在體實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)DEX可以激活A(yù)MPK發(fā)揮其在心肌缺血再灌注損傷中的抗氧化應(yīng)激作用[6]，本研究在這些研究基礎(chǔ)上，進一步發(fā)現(xiàn)了其對Huvecs的保護機制。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于ogd/r組來說，DEX+ogd/r組Huvecs的p-AMPKα水平上升；相對于DEX+ogd/r組來說，DEX+YHB+ogd/r組p-AMPKα水平降低，這說明DEX預(yù)處可能通過激活A(yù)MPKα發(fā)揮其對Huvecs的保護作用，而該作用可以被YHB拮抗。本研究發(fā)現(xiàn)在氧糖剝奪再復(fù)氧前給予DEX預(yù)處理2 h既能明顯提高p-AMPKα水平，而YHB使DEX的效應(yīng)有所逆轉(zhuǎn)。近期有研究發(fā)現(xiàn)DEX對心肌缺血再灌注損傷的保護作用可能與AMPKα依賴的自噬有關(guān)[7]，DEX也有可能通過自噬發(fā)揮對Huvecs的保護作用，這個推論需要進一步證實。AMPKα分子被認為是細胞內(nèi)部能量與代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子之一，其在糖尿病、高脂血癥、肥胖癥等多種與代謝相關(guān)的疾病中均有重要作用[8]。 在大鼠糖尿病模型中，DEX可以通過激活A(yù)MPKα減輕氧化應(yīng)激損傷[9]，同時在過氧化氫誘導(dǎo)的Huvecs損傷模型中，AMPKα分子的激活對Huvecs有保護作用[10-11]，而缺氧復(fù)氧過程中氧化應(yīng)激也是細胞損傷的主要機制之一。據(jù)此，作者推論:DEX通過激活A(yù)MPKα減輕氧糖剝奪再復(fù)氧時Huvecs的氧化應(yīng)激損傷，而其對血管內(nèi)皮細胞通透性和死亡形式的影響，需要進一步探究。

DEX作為一種麻醉輔助藥，能顯著降低全麻手術(shù)患者應(yīng)激和炎性反應(yīng)水平，有助于改善患者的臨床療效[12],動物實驗如在膿毒癥小鼠身上也證實其有抗炎作用[13]，而血管內(nèi)皮細胞作為組織與血液的第一屏障，其在機體應(yīng)激和炎癥等病理生理過程中發(fā)揮著重要作用，血管內(nèi)皮細胞也許是DEX發(fā)揮圍術(shù)期器官保護作用的靶點之一?，F(xiàn)有研究證實AMPKα不僅對缺氧復(fù)氧條件下血管內(nèi)皮細胞的功能有影響，并且參與了Huvecs炎性反應(yīng)[14]；據(jù)此認為DEX可能會通過AMPKα分子發(fā)揮其對Huvecs的抗炎作用，需要進一步的實驗證實這個猜想并尋找該通路的下游靶分子。

AMPKα分子被認為是細胞內(nèi)部能量與代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子之一，該分子的激活可以提高細胞對葡萄糖的攝取，抑制蛋白質(zhì)、糖原和脂類的合成，促進糖類有氧氧化和脂類的分解代謝，從而為細胞提供更多能量[15]?，F(xiàn)有研究認為DEX可以提高293細胞的線粒體呼吸功能[16]，據(jù)此推測DEX可能是通過激活該分子改善了Huvecs的內(nèi)部能量代謝，所以本研究還進行了線粒體呼吸功能檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于NC組來說，50 mol/L DEX明顯提高了線粒體的有氧呼吸能力，同樣用α2腎上腺素受體的拮抗劑YHB之后，該作用被削弱。

綜上所述，DEX在提高了p-AMPKα水平后，會進一步影響線粒體的生物合成能力，線粒體的氧氣消耗速率間接地反映了線粒體的有氧氧化水平和生物合成能力。在氧糖剝奪條件下，細胞是處于一種無氧無能量來源的狀態(tài)，此時的細胞要適應(yīng)這種極端環(huán)境需要一定的能量儲備。在本研究中發(fā)現(xiàn)DEX預(yù)處理可以提高線粒體的有氧呼吸能力，使細胞在氧糖剝奪處理前細胞內(nèi)部能量儲備量升高，以滿足Huvecs在氧糖剝奪狀態(tài)下的能量需求。結(jié)合本課題組前期的實驗結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：DEX預(yù)處理通過激活α2受體提高p-AMPKα水平，p-AMPKα可通過促進細胞對葡萄糖的攝取，促進生成能量的生物化學(xué)反應(yīng)，抑制消耗能量的物質(zhì)合成反應(yīng)，提高線粒體的呼吸功能，增加細胞內(nèi)部能量儲備，這有利于Huvecs細胞適應(yīng)氧糖剝奪的極端環(huán)境，利于細胞的生存，減輕細胞損傷，而DEX對Huvecs的通透性和死亡形式及炎性反應(yīng)的影響，需要進一步探索。