王爽爽，史冊(cè)，劉蒼維，胡月，周怡君，閆廣興，孫宏晨

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院口腔病理科，遼寧省口腔疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110002；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院病理科，長(zhǎng)春 130021；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，遼寧省口腔疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110002；4.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，長(zhǎng)春 130021）

牙本質(zhì)是牙齒的主體結(jié)構(gòu)，是由分化成熟的成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌的基質(zhì)礦化形成。在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過(guò)程中，細(xì)胞的極化是成牙本質(zhì)細(xì)胞成熟并發(fā)揮功能不可缺少的環(huán)節(jié)。因此，研究成牙本質(zhì)細(xì)胞的極化或極性建立的過(guò)程及調(diào)控機(jī)制對(duì)進(jìn)一步理解牙本質(zhì)的形成過(guò)程具有重要意義。細(xì)胞極性是指細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上的不對(duì)稱(chēng)性，包括頂?shù)准?xì)胞極性（apico-basal cell polarity，ABP）、平面細(xì)胞極性、前后細(xì)胞極性和不對(duì)稱(chēng)細(xì)胞分裂［1］。成牙本質(zhì)細(xì)胞具有典型的ABP特征，但目前對(duì)該細(xì)胞的頂?shù)讟O性所知甚少。已有對(duì)ABP的研究多集中于上皮細(xì)胞，由于成牙本質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞在形態(tài)、功能、成分及發(fā)育過(guò)程中存在很多相似之處［2］，因此，本研究擬基于對(duì)上皮細(xì)胞極性的了解探討成牙本質(zhì)細(xì)胞的極性特征。

成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化過(guò)程有多種信號(hào)通路參與，其中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP） 信號(hào)通路在此過(guò)程中必不可少［3］。本研究組已證明在小鼠牙源性間充質(zhì)中敲除BMP受體活化素A受體1（activin A receptor type 1，Acvr1） 基因后，形成骨樣牙本質(zhì)［4］，且前期牙本質(zhì)增厚［5］，但具體的細(xì)胞學(xué)機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過(guò)在小鼠牙源性間充質(zhì)細(xì)胞中敲除Acvr1基因，用組織學(xué)和免疫熒光（immunofluorescence，IF） 染色等方法進(jìn)一步探索ACVR1在成牙本質(zhì)細(xì)胞極性和牙本質(zhì)形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：利用基因型為Acvr1 fx/fx和Acvr1 +/-；Osterix-Cre（+）/（-） 的基因修飾小鼠配對(duì)合籠［5］，收集子代小鼠。敲除組小鼠基因型為Osterix-Cre（+）/（-）；Acvr1fx/-，對(duì)照組小鼠基因型為Osterix-Cre（+）/（-）；Acvr1fx/+。收集出生后21 d（postnatal day 21，PN21） 小鼠下頜骨用于本研究。

1.1.2 儀器及試劑：熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；包埋機(jī)、切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；小鼠抗GM130抗體（美國(guó)B&D公司）；小鼠抗頂端極性蛋白激酶C zeta（protein kinases C Zeta，PKCζ） 抗體（美國(guó)Santa Cruze公司）；兔抗ZO-1抗體、FITC標(biāo)記親和純化山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（美國(guó)Proteintech公司）；DAPI溶液、天狼星紅試劑盒（中國(guó)Solarbio公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本制備：收集對(duì)照組及敲除組PN21小鼠，分離下頜骨，4%多聚甲醛4 ℃固定過(guò)夜，次日15%EDTA脫鈣，脫鈣3周后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。3 μm厚度連續(xù)切片，于4 ℃保存。

1.2.2 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE） 染色：烤片，常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色5 min，沖洗，分化10 s，返藍(lán)10 s，伊紅染色10 min。常規(guī)梯度脫水、透明，中性樹(shù)膠封片，觀察拍照，常溫保存。

1.2.3 IF染色：將切片常規(guī)脫蠟至水后，置于PBS緩沖液中，95 ℃檸檬酸水浴修復(fù)5 min，冷卻至室溫，PBS沖洗5 min 3次，BSA室溫封閉1 h，加入一抗（ZO-1，1∶100；GM130，1∶200；PKCζ，1∶200），37 ℃孵育2 h，PBS沖洗5 min 3次，熒光二抗（羊抗兔或羊抗鼠） 室溫避光孵育2 h，PBS沖洗5 min 3次，水溶性防淬滅DAPI封片后拍照。

1.2.4 天狼星紅染色：將切片常規(guī)脫蠟至水，鐵蘇木素染色液weigert A和B染液按1∶1混合，用移液槍吸取100 μL（取液量以能完全覆蓋組織面為準(zhǔn)） 混合液滴于組織上，濕盒內(nèi)染色20 min，水洗5 min后，將天狼星紅染色液100 μL滴于組織上，濕盒內(nèi)37 ℃染色1 h，流水稍微沖洗，去除切片表面染液。常規(guī)脫水、透明，中性樹(shù)膠封固。明場(chǎng)和偏光鏡下拍照，染色后的切片常溫保存。

2 結(jié)果

2.1 Acvr1敲除后形成骨樣牙本質(zhì)，成牙本質(zhì)細(xì)胞形態(tài)異常

PN21小鼠下頜切牙標(biāo)本HE染色可見(jiàn)，對(duì)照組小鼠切牙礦化牙本質(zhì)和前期牙本質(zhì)分界清晰平坦，且厚度均勻（圖1B），成牙本質(zhì)細(xì)胞呈高柱狀，細(xì)胞排列整齊有序（圖1C），并可見(jiàn)細(xì)胞核遠(yuǎn)離牙本質(zhì)側(cè)，位于細(xì)胞的基底端（圖1C放大圖）。與對(duì)照組相比，敲除組小鼠切牙礦化牙本質(zhì)和前期牙本質(zhì)分界線(xiàn)曲折不平，厚度不均，前期牙本質(zhì)層明顯增厚（圖1F），牙尖處有細(xì)胞埋在牙本質(zhì)內(nèi)形成骨樣牙本質(zhì)（圖1E箭頭處），成牙本質(zhì)細(xì)胞排列散亂不規(guī)則（圖1F），細(xì)胞喪失高柱狀形態(tài)，變?yōu)榘鶢罨蛄⒎綘?，?xì)胞核排列不規(guī)律（圖1F放大圖）。說(shuō)明ACVR1通過(guò)影響成牙本質(zhì)細(xì)胞的極性促進(jìn)了成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化，從而影響牙本質(zhì)的形成。

圖1 PN21小鼠下頜切牙HE染色Fig.1 HE staining of mandibular incisors in mice at PN21

2.2 Acvr1基因敲除后成牙本質(zhì)細(xì)胞內(nèi)極性相關(guān)蛋白定位異常

IF染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞內(nèi)緊密連接蛋白ZO-1（圖2B、2D） 和PKCζ（圖3B、3D）均勻有序表達(dá)于細(xì)胞頂端，而在敲除組小鼠切牙成牙本質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，上述蛋白表達(dá)位置由細(xì)胞頂端轉(zhuǎn)移至細(xì)胞基底側(cè)，且排列不規(guī)則（圖2F、2H、3F、3H）。同樣，GM130 IF染色可見(jiàn)高爾基體相對(duì)細(xì)胞核的位置發(fā)生改變，對(duì)照組高爾基體位于胞核的頂端側(cè)（圖4B、4D），而敲除組小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞內(nèi)高爾基體與細(xì)胞核的位置不固定，大部分高爾基體位于細(xì)胞核的牙髓側(cè)即細(xì)胞底端，有些則位于細(xì)胞側(cè)面（圖4F、4H）。說(shuō)明ACVR1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)緊密連接蛋白、極性蛋白和高爾基體的定位，從而促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞的極化。

圖2 PN21小鼠下頜切牙ZO-1免疫熒光染色Fig.2 IF staining of ZO-1 in mandibular incisors at PN21

圖3 PN21小鼠下頜切牙PKCζ免疫熒光染色Fig.3 IF staining of PKCζ in mandibular incisors at PN21

圖4 PN21小鼠下頜切牙GM130免疫熒光染色Fig.4 IF staining of GM130 in mandibular incisors at PN21

2.3 Acvr1基因敲除后牙本質(zhì)膠原纖維無(wú)序排列且成熟度降低

對(duì)PN21小鼠切牙行HE染色和IF染色，結(jié)果表明，Acvr1基因敲除后成牙本質(zhì)細(xì)胞喪失極性形態(tài)，推測(cè)成牙本質(zhì)細(xì)胞功能可能受到影響。因此，利用天狼星紅染色檢測(cè)牙本質(zhì)膠原的排列和成熟程度。偏振光顯微鏡下可見(jiàn)對(duì)照組切牙牙本質(zhì)膠原染色呈鮮亮的橙紅色（圖5B），膠原纖維束有序排列（圖5E、5F、5G），而敲除組小鼠牙本質(zhì)膠原染色呈黃綠色（圖5D），成熟程度較低，且可見(jiàn)膠原纖維排列稀疏不規(guī)則（圖5H、5I、5J）。說(shuō)明ACVR1促進(jìn)了牙本質(zhì)膠原的有序排列和成熟。

圖5 PN21小鼠下頜切牙天狼星紅染色Fig.5 Sirius red staining of mandibular incisors at PN21

3 討論

上皮細(xì)胞頂?shù)讟O性具有以下特征：（1） 相鄰兩極性上皮細(xì)胞之間形成緊密連接、黏附連接、縫隙連接和橋粒，其中緊密連接分隔細(xì)胞頂端面和基底側(cè)面；（2） 極性上皮細(xì)胞內(nèi)有3種極性復(fù)合體，包括PAR（PAR3/PAR6/aPKC） 復(fù)合體、Crumbs（CRB/PALS1/PATJ） 復(fù)合體和Scribble（SCRIB/LGL/DLG） 復(fù)合體，其中PAR復(fù)合體在細(xì)胞極化過(guò)程中發(fā)揮主要作用［6］；（3） 細(xì)胞在建立極性的過(guò)程中細(xì)胞器發(fā)生重定位。成熟的成牙本質(zhì)細(xì)胞是具有典型頂?shù)讟O性特征的細(xì)胞，細(xì)胞呈高柱狀緊密平行排列，細(xì)胞頂端有成牙本質(zhì)細(xì)胞突突入前期牙本質(zhì)和牙本質(zhì)，基底面朝向牙髓側(cè)，細(xì)胞核整齊排列在細(xì)胞基底端。成牙本質(zhì)細(xì)胞的極性建立（也稱(chēng)極化） 是其正常分化且發(fā)揮功能的關(guān)鍵一步。眾所周知，BMP信號(hào)通路是成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和牙本質(zhì)形成過(guò)程中非常重要的信號(hào)通路，本課題組的前期研究［5］表明，Ⅰ型BMP受體Acvr1基因敲除后形成骨樣牙本質(zhì)，且前期牙本質(zhì)增厚，為進(jìn)一步研究ACVR1在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和牙本質(zhì)形成中的作用，本研究應(yīng)用Osterix-Cre在小鼠牙源性間充質(zhì)細(xì)胞中敲除Acvr1基因，觀察牙本質(zhì)的形成及細(xì)胞間連接、極性蛋白復(fù)合體及高爾基體的定位。

本研究結(jié)果顯示，Acvr1基因敲除后的小鼠切牙成牙本質(zhì)細(xì)胞喪失高柱狀形態(tài)，細(xì)胞核排列雜亂無(wú)章，形態(tài)學(xué)上提示了成牙本質(zhì)細(xì)胞的極性紊亂。為了進(jìn)一步明確極性相關(guān)蛋白在成牙本質(zhì)細(xì)胞中的定位，進(jìn)一步行ZO-1、PKCζ和GM130 IF染色。ZO-1是細(xì)胞間緊密連接蛋白。研究［7］表明，3D培養(yǎng)的犬腎細(xì)胞整齊排列形成單個(gè)管狀結(jié)構(gòu)，而敲除緊密連接蛋白ZO-1基因后，細(xì)胞緊密連接組裝和極性建立出現(xiàn)延遲，細(xì)胞排列雜亂無(wú)章，形成多個(gè)管腔或無(wú)管腔結(jié)構(gòu)。頂端極性蛋白復(fù)合物Par6/Par3/aPKC對(duì)促進(jìn)緊密連接的形成具有關(guān)鍵作用，其中aPKC是多種細(xì)胞建立極性過(guò)程中發(fā)揮磷酸化作用的關(guān)鍵酶［8］。PKCζ是aPKC的一個(gè)亞型［9］，可磷酸化閉合蛋白，以促進(jìn)緊密連接組裝［10］。在調(diào)節(jié)細(xì)胞極性所必需的極性蛋白中，有一半以上被鑒定為aPKC的底物。aPKC的缺失會(huì)導(dǎo)致果蠅胚胎上皮細(xì)胞喪失頂?shù)讟O性［11］。GM130是高爾基復(fù)合體的標(biāo)志物，極性狀態(tài)下，細(xì)胞核位于細(xì)胞的基底端，高爾基體分布在細(xì)胞核的頂端，高爾基體與細(xì)胞核的相對(duì)位置決定了具有頂?shù)讟O性的細(xì)胞的分泌軸方向［8，12］。越來(lái)越多的證據(jù)表明高爾基體與細(xì)胞極化有關(guān)［12］。在小鼠浦肯野神經(jīng)元中敲除高爾基體基質(zhì)蛋白GM130會(huì)導(dǎo)致高爾基體斷裂和高爾基體定位缺陷，進(jìn)而使細(xì)胞分泌物極化運(yùn)輸受損，細(xì)胞形態(tài)改變，浦肯野細(xì)胞樹(shù)突萎縮［13］。因此，ZO-1、PKCζ和高爾基復(fù)合體的定位決定了細(xì)胞的極化狀態(tài)。本研究中，IF染色結(jié)果表明這3種蛋白在敲除組中的定位均出現(xiàn)異常，說(shuō)明Acvr1基因敲除后，可能通過(guò)影響PKCζ的定位，導(dǎo)致緊密連接蛋白的組裝異常，成牙本質(zhì)細(xì)胞不能建立極性，高爾基體定位無(wú)規(guī)律，進(jìn)一步影響成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌牙本質(zhì)基質(zhì)。

此外，HE染色結(jié)果還顯示，Acvr1基因敲除后，礦化牙本質(zhì)和前期牙本質(zhì)之間以及前期牙本質(zhì)和成牙本質(zhì)細(xì)胞層之間的分界線(xiàn)曲折不平，前期牙本質(zhì)和礦化牙本質(zhì)厚度不均，還可見(jiàn)骨樣牙本質(zhì)形成，這可能是由于牙本質(zhì)膠原分泌和（或） 礦化過(guò)程受到影響。成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌牙本質(zhì)基質(zhì)的方向由高爾基體與細(xì)胞核的相對(duì)位置決定，GM130定位異常提示成牙本質(zhì)細(xì)胞不能正常建立極性，進(jìn)一步影響細(xì)胞器的定位，使細(xì)胞分泌軸的方向改變，導(dǎo)致骨樣牙本質(zhì)的形成，同時(shí)也影響細(xì)胞的分泌功能［12］，導(dǎo)致礦化牙本質(zhì)和前期牙本質(zhì)之間以及前期牙本質(zhì)和成牙本質(zhì)細(xì)胞層之間分界不清。為了進(jìn)一步明確Acvr1基因敲除后成牙本質(zhì)細(xì)胞的分泌功能是否受到影響，行天狼星紅染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Acvr1基因敲除后牙本質(zhì)膠原排列不整齊，且膠原成熟度降低。提示喪失極性的成牙本質(zhì)細(xì)胞由于細(xì)胞分泌軸的改變影響了膠原纖維的定向分泌，進(jìn)而影響了膠原纖維束的有序排列和成熟。

綜上所述，本研究探討了小鼠牙源性間充質(zhì)中ACVR1在調(diào)節(jié)成牙本質(zhì)細(xì)胞極性和促進(jìn)牙本質(zhì)形成中的作用，發(fā)現(xiàn)ACVR1可能通過(guò)定位PKCζ促進(jìn)緊密連接蛋白的組裝，高爾基體重定位，使成牙本質(zhì)細(xì)胞建立極性，進(jìn)而有序分泌牙本質(zhì)基質(zhì)并礦化形成牙本質(zhì)。但ACVR1影響成牙本質(zhì)細(xì)胞極性的具體機(jī)制以及對(duì)牙本質(zhì)基質(zhì)分泌和（或） 礦化階段的影響仍需進(jìn)一步探討。