羅水妹，張琦，黃誼強(qiáng)，謝賢和，2

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，福建醫(yī)科大學(xué)分子腫瘤研究所，福州 350005；2.福建省癌癥精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350005）

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC） 是頭頸部癌癥中最常見(jiàn)的類(lèi)型。其中，鼻咽癌居首位，統(tǒng)計(jì)顯示2020年全球鼻咽癌發(fā)病13.3萬(wàn)余人，死亡達(dá)8萬(wàn)人［1］。盡管鼻咽癌對(duì)放射治療（簡(jiǎn)稱(chēng)放療） 相對(duì)敏感，但中晚期鼻咽癌放療后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移一直是治療的難點(diǎn)。因此，尋找新的鼻咽癌治療方法迫在眉睫。

細(xì)胞焦亡是一種新的程序性細(xì)胞死亡方式，以細(xì)胞膜孔形成、細(xì)胞腫脹、細(xì)胞溶解和炎性細(xì)胞因子釋放著稱(chēng)［2］，是宿主抵御感染和危險(xiǎn)信號(hào)的關(guān)鍵，近年來(lái)已成為腫瘤領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。cyclin B1是細(xì)胞周期G2/M期的關(guān)鍵檢查點(diǎn)蛋白，參與有絲分裂過(guò)程中染色體凝聚、核膜破裂和紡錘體組裝等過(guò)程［3］，在胃癌［4］、肺癌［5］、食管癌［6］等多種腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤惡性表型相關(guān)。研究［7］顯示，cyclin B1高表達(dá)的HNSC患者放療后局部復(fù)發(fā)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高于低表達(dá)患者，提示cyclin B1高表達(dá)可能與HNSC放療抵抗相關(guān)，因此，cyclin B1可能是頗具潛力的腫瘤治療新靶點(diǎn)。本研究組前期研究［8］顯示，敲低cyclin B1可抑制Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。此外，靶向敲低鼻咽癌細(xì)胞cyclin B1表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬［9］。cyclin B1與細(xì)胞焦亡的相關(guān)性目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬探討下調(diào)cyclin B1對(duì)HNSC細(xì)胞焦亡的影響，旨在發(fā)現(xiàn)HNSC治療的新靶點(diǎn)和拓寬治療思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

cyclin B1在HNSC與正常組織的差異表達(dá)分析數(shù)據(jù)來(lái)自GEO［10］及UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)［11］；cyclin B1的免疫組化數(shù)據(jù)源于Human Protein Atlas（HPA） 數(shù)據(jù)庫(kù)［12］；cyclin B1與HNSC的生存分析數(shù)據(jù)源于GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)［13］；細(xì)胞焦亡基因及cyclin B1的表達(dá)譜數(shù)據(jù)來(lái)源于OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)［14］。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.2.1 主要試劑和儀器：人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2由福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。人鼻咽癌細(xì)胞株HONE-1購(gòu)自上海中亞生物公司。cyclin B1及陰性對(duì)照（negative control，NC） 的siRNA購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司。GP-transfect-mate購(gòu)自中國(guó)GenePharma公司。cyclin B1抗體（ab23053）、GSDMD抗體（ab215203）、GSDME抗體（ab215191）、caspase 1（CASP1） 抗體（ab207802）、caspase 3（CASP3）抗體（ab32351） 購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。內(nèi)參β-actin抗體（AF7018）、GAPDH抗體（AF7021） 購(gòu)自美國(guó)Affinity公司。凝膠成像儀（Biosciences AccuriC6型） 購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，相差顯微鏡（IX50/70型） 購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素1 000 U/mL、鏈霉素0.1 mg/mL） 的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)人鼻咽癌CNE-2、HONE-1細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（1.5×105/孔） 接種于6孔板，加入無(wú)抗完全培養(yǎng)基，融合度為40%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以O(shè)PTI-MEM分別稀釋siRNA和GP-transfect-mate，室溫靜置5 min，混勻形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫下再靜置20 min后加入至細(xì)胞培養(yǎng)基（siRNA終濃度100 nmol/L，GP-transfect-mate按照試劑說(shuō)明書(shū)使用），轉(zhuǎn)染后4～6 h更換為新培養(yǎng)基。cyclin B1-siRNA序列：正義為5’-CCAUGUUUAUUGCAAGCAATT-3’，反義為5’-UUGCUUGCAAUAAACAUGGTT-3’。NC-siRNA序列：正義為5’-UUCUCCGAACGUGUCA CGUTT-3’，反 義為5’-ACGUGACACGUUCGGAG AATT-3’。

1.2.4 蛋白印跡檢測(cè)：轉(zhuǎn)染48 h后，按常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白。上樣量為每泳道20 μg，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜（0.45 μm PVDF膜），室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗過(guò)夜，TBST洗膜，室溫孵育二抗1h，TBST洗脫，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。導(dǎo)出照片后用Adobe Photoshop軟件讀取各條帶灰度值。

1.2.5 高通量全轉(zhuǎn)錄本基因芯片檢測(cè)：將已驗(yàn)證cyclin B1敲低及對(duì)照組CNE-2細(xì)胞樣本送上海市吉?jiǎng)P基因有限公司，進(jìn)行Clariom D全轉(zhuǎn)錄本基因芯片檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果篩選差異表達(dá)基因。

1.2.6 相差顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞焦亡形態(tài)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h置于相差顯微鏡下，于亮場(chǎng)下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照記錄。

1.2.7 ELISA檢測(cè)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h更換為無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基，再過(guò)24 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，于4 ℃、3 000 r/min離心20 min，取上清按照人白細(xì)胞介素（interlukin，IL） -1β ELISA kit（JL13662，江萊生物公司） 操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用GraphPad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間結(jié)果比較用t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各基因集交集韋恩圖通過(guò)EVenn在線可視化工具（http：//www.ehbio.com/test/venn/#/）［15］實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 cyclin B1表達(dá)及其與臨床特征的關(guān)系

GSE12452數(shù)據(jù)集（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE12452）（圖1A）、GSE13601數(shù)據(jù)集（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE13601）（圖1B） 及UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ualcan.path.uab.edu） 分析（圖1C） 顯示，HNSC組織cyclin B1的表達(dá)水平分別高于正常組織的4.35倍（P＜ 0.000 1）、5.26倍（P＜ 0.000 1） 及2.42倍（P＜ 0.000 1）。HPA數(shù)據(jù)庫(kù)［12］（https：//www.proteinatlas.org/ENSG000 00134057-Cyclin B1/pathology/head+and+neck+cancer） 分析顯示，cyclin B1在頭頸正常組織中低表達(dá)，而在HNSC組織呈中等強(qiáng)度表達(dá)（圖1D、1F），提示cyclin B1在HNSC中蛋白及mRNA水平均為過(guò)表達(dá)。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)［11］進(jìn)一步分析顯示，cyclin B1表達(dá)水平與HNSC組織分級(jí)、腫瘤分期顯著相關(guān)，組織分級(jí)越高，其表達(dá)水平越高（圖2A），在2、3期患者中表達(dá)水平最高（圖2B）。

圖1 GEO、ULCAN及HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中cyclin B1在HNSC與正常組織中的表達(dá)Fig.1 Cyclin B1 expression in HNSC and normal control group in GEO，ULCAN and HPA databases

圖2 cyclin B1表達(dá)與臨床特征的關(guān)系Fig.2 Correlation between cyclin B1 expression and clinical parameters

2.2 cyclin B1表達(dá)水平與HNSC的預(yù)后顯著相關(guān)

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)［13］（http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php） 分析提示，HNSC患者中cyclin B1高表達(dá)組（以中位數(shù)為分界） 的無(wú)病生存期（disease free survival，DFS） 短于低表達(dá)組（HR=1.4，P=0.043）（圖3）。

圖3 cyclin B1表達(dá)與HNSC患者DFS的相關(guān)性Fig.3 Correlation between cyclin B1 expression and disease free survival in HNSC patients

2.3 cyclin B1與細(xì)胞焦亡基因的相關(guān)性分析

33個(gè)細(xì)胞焦亡相關(guān)基因、GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)［13］及GSE13601數(shù)據(jù)集篩選差異表達(dá)基因取交集結(jié)果顯示，GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)、GSE13601數(shù)據(jù)集分別篩選出6個(gè)（GSDMB，GSDMD，NLRP1，PLCG1，AIM2，IL1B） 和4個(gè)（CASP1，CASP4，AIM2，IL1B） 具有差異表達(dá)的細(xì)胞焦亡基因（圖4A、4B）。OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)［14］獲取496例HNSC患者cyclin B1及33個(gè)細(xì)胞焦亡基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析顯示，27.27%（9/33） 的細(xì)胞焦亡基因（AIM2，CASP6，GSDMD，NOD2，CASP8，GSDMA，SCAF11，GSDMB，CASP3） 在cyclin B1高表達(dá)組與低表達(dá)組（以中位數(shù)為界） 存在差異表達(dá)（圖4C），提示HNSC中cyclinB1的表達(dá)可能與細(xì)胞焦亡生物學(xué)過(guò)程相關(guān)。

圖4 HNSC與正常組織差異表達(dá)的細(xì)胞焦亡基因及其與cyclin B1表達(dá)的相關(guān)性Fig.4 Differential expression of pyroptosis genes between HNSC and normal and its correlation with cyclin B1 expression

2.4 cyclin B1與HNSC細(xì)胞焦亡的相關(guān)性

2.4.1 HONE-1、CNE-2細(xì)胞cyclin B1敲低效率檢測(cè)：HONE-1、CNE-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后提取蛋白進(jìn)行蛋白印跡檢測(cè)，結(jié)果顯示，cyclin B1敲低組（轉(zhuǎn)染cyclin B1-siRNA，命名為KD組） 的cyclin B1蛋白表達(dá)較對(duì)照組（轉(zhuǎn)染NC-siRNA，命名為NC組） 明顯減弱，敲低效率分別為61.80%、85.99%（圖5A、5B）。

2.4.2 高通量基因芯片檢測(cè)cyclin B1敲低后差異表達(dá)基因：ClariomD全轉(zhuǎn)錄本基因芯片檢測(cè)結(jié)果篩選出cyclin B1KD組（n=3） 與NC組（n=3） 差異表達(dá)的基因1 480個(gè)，其中包括細(xì)胞焦亡關(guān)鍵基因CASP1（圖5C、5D）。

圖5 cyclin B1敲低效率檢測(cè)及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選差異表達(dá)的細(xì)胞焦亡基因Fig.5 Detection of cyclin B1 knockdown efficiency and transcriptome sequencing screening of differentially expressed pyrotopia genes

2.4.3 相差顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞焦亡形態(tài)：細(xì)胞焦亡在光鏡下主要表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹膨大、細(xì)胞膜表面可見(jiàn)氣泡樣突出物。CNE-2、HONE-1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染cyclin B1siRNA 48 h后于相差顯微鏡下觀察，可見(jiàn)KD組具有焦亡形態(tài)的細(xì)胞顯著多于NC組（圖6）。

圖6 相差顯微鏡下觀察HONE-1、CNE-2細(xì)胞焦亡形態(tài)Fig.6 Pyrophosis morphology of HONE-1 and CNE-2 cells observed by phase contrast microscope

2.4.4 蛋白印跡檢測(cè)細(xì)胞焦亡關(guān)鍵蛋白：轉(zhuǎn)染后48 h，提取蛋白行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞焦亡執(zhí)行蛋白GSDMD、GSDME前體及裂解片段以及焦亡信號(hào)通路的關(guān)鍵分子CASP1、CASP3的前體及裂解片段，結(jié)果顯示，2組均可檢測(cè)到CASP1、CASP3裂解片段（圖7A、7B），與對(duì)照組相比，cyclin B1敲低組的GSDMD、GSDME裂解片斷有增加的趨勢(shì)（圖7C、7D）。

圖7 蛋白印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48 h CASP1、CASP3蛋白的前體和裂解片段以及GSDMD、GSDME蛋白全長(zhǎng)和裂解片段Fig.7 Western blotting detection of precursors and cleavage fragments of CASP1 and CASP3 and full length and cleavage fragments of GSDMD and GSDME 48 h after transfection

2.4.5 ELISA檢測(cè)IL-1β：轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，通過(guò)ELISA檢測(cè)IL-1β，結(jié)果顯示，2組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05），但cyclin B1敲低組的IL-1β水平有較對(duì)照組增多的趨勢(shì)（圖8）。

圖8 ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞上清中IL-1β水平Fig.8 ELISA dection of IL-1β level in cell supernatant 48 h after transfection

3 討論

cyclin B1在細(xì)胞周期G2/M期轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在多種癌組織中異常高表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖失控［3-6］。腫瘤是以細(xì)胞增殖、分化與細(xì)胞死亡平衡失調(diào)為特征的疾病，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡是目前各種抗腫瘤治療的目的。本課題組前期研究［8］顯示，沉默cyclin B1可顯著抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而沉默鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的cyclin B1表達(dá)可通過(guò)AMPK-ULK1通路觸發(fā)自噬［9］，提示其可能成為腫瘤治療的潛在靶標(biāo)。細(xì)胞死亡形式主要分為程序性和非程序性細(xì)胞死亡兩大類(lèi)。程序性細(xì)胞死亡一直是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，主要包括細(xì)胞凋亡、自噬及焦亡。細(xì)胞焦亡作為最新被證實(shí)的程序性死亡方式之一，與細(xì)胞周期關(guān)鍵檢查點(diǎn)分子cyclin B1的關(guān)系目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究探討了cyclin B1對(duì)HNSC細(xì)胞焦亡的影響，有助于全面揭示cyclin B1在HNSC中發(fā)揮的生物學(xué)功能，為探討cyclin B1能否成為腫瘤治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。本研究通過(guò)大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)cyclin B1在HNSC組織中顯著高表達(dá)，且與HNSC組織分級(jí)和分期顯著相關(guān)，提示cyclin B1在HNSC的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。

細(xì)胞焦亡以Gasdermin家族蛋白N端裂解片段在細(xì)胞膜上形成1～2 nm孔隙，使膜失去完整性，進(jìn)而釋放出大量炎性細(xì)胞因子和炎性細(xì)胞內(nèi)容物為特征［2］。本研究結(jié)合GEO、TCGA等數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)8個(gè)細(xì)胞焦亡基因在HNSC與正常組織中存在差異表達(dá)，提示細(xì)胞焦亡可能在HNSC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)9個(gè)細(xì)胞焦亡相關(guān)基因與cyclin B1的表達(dá)水平存在相關(guān)性，提示cyclin B1表達(dá)可能參與HNSC細(xì)胞焦亡的生物學(xué)過(guò)程。據(jù)此，進(jìn)一步以鼻咽癌細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)沉默CNE-2細(xì)胞的cyclin B1表達(dá)后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果顯示cyclin B1沉默可顯著增加細(xì)胞焦亡通路關(guān)鍵分子CASP1的表達(dá)，也進(jìn)一步支持了cyclin B1與細(xì)胞焦亡存在相關(guān)性的結(jié)論。

細(xì)胞焦亡經(jīng)典通路中，由NLRP3、NLRC4、AIM2、pyrin和NLRP1組裝成的典型炎癥小體負(fù)責(zé)CASP1前體的切割［16-17］，而CASP1前體被處理后的裂解片段則可進(jìn)一步處理GSDMD，使其釋放出N端結(jié)構(gòu)域發(fā)揮膜穿孔的功能［18］，可觸發(fā)焦亡及誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子（IL-1β、IL-18） 的釋放［19-20］。另有研究［21］顯示，GSDME可被CASP3特異性剪切生成GSDME-N端片段誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默HONE-1、CNE-2細(xì)胞cyclin B1后，相差顯微鏡下觀察到cyclin B1敲低組具有焦亡形態(tài)的細(xì)胞顯著多于對(duì)照組，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示cyclin B1敲低組細(xì)胞釋放的IL-1β較對(duì)照組升高，蛋白印跡結(jié)果顯示2組均可見(jiàn)CASP1、CASP3裂解片段，與對(duì)照組相比，cyclin B1敲低組的細(xì)胞焦亡執(zhí)行蛋白GSDMD-N端片段及GSDME-N端片段有增加的趨勢(shì)，但2組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此，cyclin B1參與細(xì)胞焦亡生物學(xué)過(guò)程是否通過(guò)經(jīng)典通路CASP1/GSDMD及CASP3/GSDME途徑實(shí)現(xiàn)仍無(wú)定論。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，cyclin B1在HNSC組織中顯著高表達(dá)，cyclin B1高表達(dá)與HNSC的不良分級(jí)、分期及DFS顯著相關(guān)，且cyclin B1表達(dá)與細(xì)胞焦亡存在相關(guān)性，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。