郭家辰，徐然

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科；2.胸外科，沈陽 110004）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率和致死率均居首位。其中，肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD） 的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，在許多國家已超過鱗狀細(xì)胞癌成為最常見的肺癌組織學(xué)類型［1］。手術(shù)切除配合放射化學(xué)治療是目前治療LUAD的主要手段。中華醫(yī)學(xué)會肺癌臨床診療指南對LUAD的一線治療方案之一為培美曲塞和鉑類藥物（如順鉑） 的聯(lián)合治療?；瘜W(xué)治療（簡稱化療） 能明顯改善LUAD患者的預(yù)后，但化療耐藥嚴(yán)重限制了化療的臨床應(yīng)用。因此，研究并發(fā)現(xiàn)提高LUAD化療敏感性的方法非常重要。

近年來，許多非編碼RNA，特別是長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA） 被證明參與了包括LUAD在內(nèi)的幾乎所有類型腫瘤化療耐藥的發(fā)生和維持［2-3］。FAM83H-AS1基因位于8q24.3，由于缺乏蛋白質(zhì)編碼能力，屬于lncRNA。目前，已有多篇文獻(xiàn)［4-5］報道FAM83H-AS1在胃癌、前列腺癌等腫瘤中的存在表達(dá)和功能異常。WANG等［6］報道FAM83HAS1高表達(dá)與LUAD患者預(yù)后不良相關(guān)，且能夠促進(jìn)LUAD的惡性進(jìn)展并抑制細(xì)胞凋亡。然而，F(xiàn)AM83HAS1在LUAD化療耐藥中的作用尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)FAM83H-AS1與LUAD化療（培美曲塞和順鉑） 耐藥相關(guān)，能通過調(diào)控多藥耐藥相關(guān)基因ATP結(jié)合盒亞家族C成員1（ATP binding cassette subfamily C member 1，ABCC1） 促進(jìn)LUAD化療耐藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：104例LUAD及相應(yīng)的正常肺組織（normal lung tissue，NLT） 標(biāo)本均經(jīng)支氣管鏡活檢或經(jīng)皮肺活檢獲得，并由2名病理學(xué)家診斷為LUAD。本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署書面知情同意書。本研究包括男37例，女67例，年齡35～79歲，中位年齡為62.9歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均確診為LUAD，在確診前未接受治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者病例信息不完整，或患有其他疾病。

確診后，57例LUAD患者選擇新輔助化療或姑息化療（培美曲塞和順鉑）。化療2～3個療程后復(fù)查胸部增強(qiáng)CT及血清腫瘤標(biāo)志物。根據(jù)病灶大小及血清腫瘤標(biāo)志物水平的變化，將患者分為敏感組（39例） 和不敏感組（18例）。

人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary artery endothelial cells，PAEC） 購自武漢云克隆公司，肺腺癌細(xì)胞系（PC9和A549） 購自寧波明舟公司；多藥耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/CR為本課題組前期構(gòu)建［7］。

1.1.2 主要試劑：培美曲塞和順鉑購自美國Sigmaaldrich公司；SYBR RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司；TRIzol和Lipofectamine 3000購自美國賽默飛公司；FAM83H-AS1抑制劑（sh-FAM83H-AS1） 及陰性對照（sh-NC） 購自廣州銳博公司；CCK8試劑盒購自上海碧云天公司；ABCC1和GAPDH抗體購自武漢云克隆公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時定量PCR：TRIzol法從組織或細(xì)胞標(biāo)本中提取總RNA，檢測RNA的純度和完整性。應(yīng)用一步法SYBR RT-PCR試劑盒擴(kuò)增FAM83H-AS1基因，按照說明書設(shè)定反應(yīng)條件。引物序列見表1。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照說明書。根據(jù)內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)進(jìn)行歸一化后，應(yīng)用比較Ct值法計(jì)算FAM83H-AS1的相對表達(dá)量，并基于相對表達(dá)量的平均值，將所有LUAD患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：所有細(xì)胞系均應(yīng)用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于5% CO2，37 ℃的條件下培養(yǎng)。將5×104個A549/CR細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。按照說明書，應(yīng)用Lipofectamine 3000將FAM83H-AS1抑制劑轉(zhuǎn)染入A549/CR細(xì)胞，培養(yǎng)5～6 h，更換培養(yǎng)基后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 藥物敏感性檢測：分別用培美曲塞（0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL和50 μg/mL）和順鉑（5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL和75 μg/mL） 處理A549/CR細(xì)胞。然后，按照說明書使用CCK8試劑盒檢測細(xì)胞活力。酶標(biāo)儀檢測每個樣本的吸光度（450 nm），并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.4 Western blotting：提取A549/CR細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量分析。取樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，4 ℃過夜封閉，與一抗（ABCC1抗體） 雜交，二抗孵育，化學(xué)發(fā)光，凝膠成像儀獲取圖像。利用Image J軟件對圖像中的條帶進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad prism 5軟件分析數(shù)據(jù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，數(shù)據(jù)以±s表示。差異比較采用單因素方差分析、t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAM83H-AS1在LUAD中高表達(dá)

與NLT組織相比，LUAD組織中FAM83H-AS1的相對表達(dá)量顯著上調(diào)（圖1A，P＜ 0.001）。與PAEC細(xì)胞相比，在PC9和A549細(xì)胞中FAM83H-AS1的相對表達(dá)量明顯增加（圖1B，P＜ 0.001）。

LUAD組織中FAM83H-AS1的表達(dá)與患者的吸煙史和化療（培美曲塞和順鉑） 不敏感相關(guān)（P＜ 0.05），與年齡、性別和TNM分期無相關(guān)性（P＞ 0.05）。見表2?；诎┌Y基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫的預(yù)后分析結(jié)果顯示，與FAM83H-AS1低表達(dá)的LUAD患者相比，F(xiàn)AM83H-AS1高表達(dá)的LUAD患者的生存時間更短，預(yù)后更差（圖1C，P＜ 0.05）。

表2 104例LUAD患者的FAM83H-AS1表達(dá)與臨床病理信息的相關(guān)性Tab.2 Correlation between FAM83H-AS1 expression and clinical pathological characteristics of 104 LUAD patients

圖1 FAM83H-AS1在LUAD中高表達(dá)Fig.1 High expression of FAM83H-AS1 in LUAD

2.2 FAM83H-AS1高表達(dá)與LUAD化療不敏感相關(guān)

與化療敏感組LUAD組織相比，不敏感組LUAD組織中FAM83H-AS1的表達(dá)顯著增加（圖2A，P＜0.05）。如圖2B和2C所示，A549細(xì)胞對培美曲塞和順鉑的IC50分別為（2.17±0.58） μg/mL和（10.86±1.97）μg/mL，而A549/CR細(xì)胞對培美曲塞和順鉑的IC50分別 為（13.48±1.37） μg/mL和（48.72±3.85） μg/mL。A549/CR細(xì)胞對培美曲塞和順鉑的耐藥系數(shù)分別為6.21和4.49，其表現(xiàn)出對培美曲塞和順鉑較強(qiáng)的耐受性。而且，與A549細(xì)胞相比，A549/CR細(xì)胞中FAM83H-AS1的表達(dá)顯著上調(diào)（圖2D，P＜ 0.05）。

圖2 FAM83H-AS1高表達(dá)與LUAD患者的化療不敏感相關(guān)Fig.2 High-expression of FAM83H-AS1 is related with insensitivity to chemotherapy in LUAD

2.3 沉默F(xiàn)AM83H-AS1提高A549/CR細(xì)胞對培美曲塞和順鉑的敏感性

實(shí)時定量PCR檢測證實(shí)轉(zhuǎn)染sh-FAM83H-AS1能夠顯著降低A549/CR細(xì)胞中FAM83H-AS1的表達(dá)（圖3A，P＜ 0.05）。與對照組相比，F(xiàn)AM83H-AS1沉默將A549/CR細(xì)胞對培美曲塞的IC50由（14.13±1.33） μg/mL降為（6.71±0.75） μg/mL（圖3B，P＜ 0.05），將對順鉑的IC50由（48.21±4.27） μg/mL降為（20.16±2.57） μg/mL（圖3C，P＜ 0.05）。沉默F(xiàn)AM83H-AS1提高了A549/CR細(xì)胞對培美曲塞和順鉑的敏感性。

圖3 沉默F(xiàn)AM83H-AS1提高A549/CR細(xì)胞對培美曲塞和順鉑的敏感性Fig.3 Silencing of FAM83H-AS1 enhances pemetrexed and cisplatin sensitivity of A549/CR cells

2.4 沉默F(xiàn)AM83H-AS1降低A549/CR細(xì)胞中的ABCC1蛋白的表達(dá)水平

基于TCGA的數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件GEPIA2進(jìn)行基因表達(dá)相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83HAS1與ABCC1基因的表達(dá)在LUAD中呈正相關(guān)（圖4A，P＜ 0.01）。而且，沉默F(xiàn)AM83H-AS1能夠抑制A549/CR細(xì)胞中ABCC1蛋白的表達(dá)（圖4B，P＜ 0.05）。

圖4 沉默F(xiàn)AM83H-AS1降低A549/CR細(xì)胞中的ABCC1蛋白的表達(dá)水平Fig.4 Silencing of FAM83H-AS1 decreases ABCC1 protein expression level in A549/CR cells

3 討論

近年來，諸多腫瘤學(xué)研究證實(shí)非編碼RNA參與了包括LUAD在內(nèi)的多種腫瘤化療耐藥的發(fā)生和維持。尤其是lncRNAs，因其數(shù)量眾多、功能和機(jī)制復(fù)雜等特點(diǎn)，引起研究者的廣泛關(guān)注。例如，SLCO4A1-AS1通 過miR-4701-5p/NFE2L1途徑激活WNT通路，促進(jìn)LUAD細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)其對順鉑的耐藥［8］；LINC00485作為分子海綿結(jié)合microRNA-195調(diào)節(jié)其靶基因CHEK1，進(jìn)而降低LUAD細(xì)胞對順鉑的化療敏感性［9］。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83H-AS1在LUAD中高表達(dá)。FAM83H-AS1的異常高表達(dá)與LUAD患者吸煙史及化療不敏感有關(guān)，而且其高表達(dá)與LUAD患者的不良預(yù)后相關(guān)。這些提示FAM83H-AS1參與了LUAD的化療耐藥，可能發(fā)揮癌基因的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)FAM83H-AS1在化療（培美曲塞和順鉑） 不敏感的LUAD組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，而且FAM83H-AS1的沉默顯著提升了化療耐藥細(xì)胞株A549/CR對培美曲塞和順鉑的敏感性。進(jìn)一步證明了FAM83H-AS1參與了LUAD的化療耐藥。

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，LUAD中FAM83HAS1與ABCC1基因的表達(dá)正相關(guān)。而且，沉默F(xiàn)AM83H-AS1能夠抑制A549/CR細(xì)胞中ABCC1蛋白的表達(dá)。ABCC1是一個經(jīng)典的多藥耐藥相關(guān)基因，屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族。ABCC1蛋白介導(dǎo)物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞，能在化療藥物起效前將其排出細(xì)胞外。諸多研究［10-11］證實(shí)ABCC1參與了幾乎所有惡性腫瘤的化療耐藥的發(fā)生，包括LUAD。據(jù)此，本研究認(rèn)為FAM83H-AS1能夠通過正性調(diào)節(jié)ABCC1基因，促進(jìn)化療藥物從細(xì)胞中排出，導(dǎo)致LUAD化療耐藥的發(fā)生。

綜上，F(xiàn)AM83H-AS1在LUAD中高表達(dá)，且與LUAD患者的化療不敏感相關(guān)，F(xiàn)AM83H-AS1能通過正性調(diào)節(jié)ABCC1基因，參與LUAD化療耐藥的形成。本研究有助于明確LUAD化療耐藥發(fā)生的分子機(jī)制，亦能夠?yàn)長UAD的臨床綜合治療提供新靶點(diǎn)。