吳立新 黃慰虎 陳曉杰 李曉峰

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌的常見類型，每年死亡人數(shù)不斷增加，晚期生存率較低[1]。盡管在手術(shù)、放療、化療和特定靶向治療方面取得了進(jìn)展，但由于診斷發(fā)現(xiàn)晚，導(dǎo)致其預(yù)后仍不理想，進(jìn)而出現(xiàn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[2]。大量的基因組學(xué)研究將肺癌與抑癌、致癌基因的表達(dá)、染色體畸變、氧化應(yīng)激等因素相聯(lián)系，這些因素影響了包括細(xì)胞生長、分裂、增殖、存活、運(yùn)動(dòng)、侵襲和細(xì)胞內(nèi)追蹤等多種細(xì)胞功能[3]。miR-378 和miR-216b 是近年來miRNA 家族中研究較多的兩種。研究顯示，miR-378 在多種腫瘤患者的血清中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，而miR-216b 呈低表達(dá)狀態(tài)。同時(shí)miR-378 和miR-216b 表達(dá)水平與患者腫瘤惡性程度具有一定的相關(guān)性[4-5]。但是目前關(guān)于這兩種miRNA 的交互作用和其在肺癌中的研究報(bào)道較少，因此本研究采用RT-qPCR 技術(shù)檢測NSCLC 患者血清miR-378 和miR-216b 表達(dá)水平，并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1研究對象 前瞻性選擇2017 年4 月至2018 年10 月浙江省榮軍醫(yī)院收治的NSCLC 患者86 例（觀察組）作為研究對象，年齡44～79（60.24±14.25）歲；另選取同期醫(yī)院健康體檢人員86 名（對照組）作為對照，年齡43～77（59.43±13.26）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫審：2017023）。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理確診為早期NSCLC；（2）臨床資料完整；（3）未進(jìn)行任何放化療；（4）未進(jìn)行手術(shù)治療；（5）所有對象知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠哺乳；（2）患者伴有嚴(yán)重心、腦、肝、腎等重要器官功能障礙；（3）合并患有其他嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾??；（4）其他惡性腫瘤。

1.3主要試劑及儀器 RNA 提取試劑盒（批號(hào)20132154）、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)2041245）、RTqPCR 試劑盒（批號(hào)2145874）均購自上海優(yōu)寧維生物有限公司。伯樂Mini-PRO 熒光定量PCR 儀（美國伯樂公司）。

1.4總RNA 提取及RT-qPCR 檢測 根據(jù)RNA 提取試劑盒提取86 例NSCLC 患者和86 名健康體檢人員血清中總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，保存至-80℃?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄腥缦拢簃iR-378正向：5'-TGGGCTAGCTAGCTGAGGGGATCGATCTCGATGCTAGCTGA-3'，反向：5'-TGGGCTGCTGCTAGCTAGTCGATCGATGCTAGCTAGCTGCTAG -3'；miR -216b 正向：5'-TGCGCTAGCTAGCTGATCGATCGATGCTAGCTAGCTAGTCGCC-3'，反向：5'-TGCGATCGATCGTAGCTAGCTAGTCGATCGTAGCTAGTCGATG-3'（中國碧云天生物科技有限公司合成）。RTqPCR 體系：SYBR Green qPCR SuperMix 16.25μL，特異性引物2.0μL，模板cDNA 3.25μL，DEPC 水補(bǔ)足 至30μL。反應(yīng)條件為：95℃，10min；95℃，10s；60℃，30s；70℃，30s；共40 個(gè)循環(huán)。設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，根據(jù)公式（2-ΔΔCT法）計(jì)算miRNA 表達(dá)。

1.5隨訪 以門診或電話隨訪的方式對所有患者進(jìn)行2 年隨訪，隨訪周期為6 個(gè)月1 次，隨訪終點(diǎn)為2020 年12 月或患者死亡。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)或配對t 檢驗(yàn)比較；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)比較；采用ROC 曲線評價(jià)血清miR-378 和miR-216b 對早期NSCLC 診斷價(jià)值，預(yù)后相關(guān)因素采用多因素Cox 回歸分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組研究對象一般資料比較 兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組研究對象一般資料比較

2.2兩組研究對象血清miR-378 與miR-216b 表達(dá)水平比較 與對照組比較，觀察組血清miR-378 水平更高，miR-216b 水平更低（P＜0.05），見表2。

表2 兩組研究對象血清miR-378 與miR-216b 水平比較（）

表2 兩組研究對象血清miR-378 與miR-216b 水平比較（）

注：對照組為健康體檢人員；觀察組為非小細(xì)胞肺癌患者；miR-378為微小RNA-378；miR-216b 為微小RNA-216b

2.3NSCLC 患者手術(shù)前后血清miR-378 與miR-216b 表達(dá)水平比較 與手術(shù)前比較，手術(shù)后患者血清miR-378 水平降低，miR-216b 水平升高（P＜0.05），見表3。

表3 NSCLC 患者手術(shù)前后血清miR-378 與miR-216b表達(dá)水平比較（）

表3 NSCLC 患者手術(shù)前后血清miR-378 與miR-216b表達(dá)水平比較（）

注：NSCLC 為非小細(xì)胞肺癌；miR-378 為微小RNA-378；miR-216b 為微小RNA-216b

2.4血清miR-378 與miR-216b 對早期NSCLC 的診斷價(jià)值 血清miR-378 診斷早期NSCLC 的曲線下面積為0.874，最佳截?cái)嘀禐?.28，敏感度為81.39%（70/86），特異度為84.88%（73/86）；血清miR-216b 診斷早期NSCLC 的曲線下面積為0.845，最佳截?cái)嘀禐?.96，敏感度為79.07%（68/86），特異度為87.20%（75/86），見圖1。

圖1 血清miR-378 與miR-216b 對早期NSCLC 的診斷ROC 曲線

2.5血清miR-378 與miR-216b 水平與NSCLC 患者臨床病理特征的關(guān)系 以手術(shù)前患者血清中miR-378 和miR-216b 表達(dá)水平均數(shù)8.13 和3.61 為界值，將患者分為miR-378 低表達(dá)組（41 例）和miR-378 高表達(dá)組（45 例），miR-216b 低表達(dá)組（44例）和miR-216b 高表達(dá)組（42 例）。兩組患者年齡和性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組患者腫瘤分期、有無淋巴轉(zhuǎn)移和腫瘤直徑比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 血清miR-378 與miR-216b 水平與NSCLC 患者臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.6miR-378、miR-216b 表達(dá)水平與NSCLC 患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪術(shù)后2 年生存率79.07%（68/86）。miR-378 低表達(dá)組術(shù)后2 年生存率90.24%（37/41），miR-378 高表達(dá)組術(shù)后2 年生存率68.89%（31/45），miR-378 低表達(dá)組生存率高于miR-378 高表達(dá)組（χ2=5.883，P=0.015）。miR-216b 低表達(dá)組術(shù)后2 年生存率72.72%（32/44），miR-216b 高表達(dá)組術(shù)后2 年生存率85.71%（36/42），miR-216b 高表達(dá)組生存率高于miR-216b 低表達(dá)組（χ2=4.782，P=0.029）。

2.7NSCLC 患者預(yù)后影響因素多因素Cox 回歸分析 多因素Cox 回歸分析得出，腫瘤分期Ⅱ期、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑≥3cm、miR-378 水平＞8.13 和miR-216b 水平＜3.61 均是影響早期NSCLC 患者預(yù)后危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表5。

表5 早期NSCLC 患者預(yù)后影響因素多因素Cox 回歸分析

3 討論

NSCLC 約占肺癌的80%，相較于小細(xì)胞肺癌，NSCLC 細(xì)胞生長較為緩慢，患者出現(xiàn)擴(kuò)散的時(shí)間相對較晚[6-7]。不同類型肺癌治療方法不同，導(dǎo)致肺癌的治療過程更加復(fù)雜，通過基因調(diào)控針對性治療肺癌已成為目前研究的熱點(diǎn)[8]。因此尋找有效且新穎的檢測指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，對提高NSCLC 患者預(yù)后具有重要意義。

miR-378 和miR-216b 已被證實(shí)在多種腫瘤中發(fā)揮著重要作用[9]。在肝癌、子宮內(nèi)膜癌和胃癌患者血清中miR-378 和miR-216b 均表達(dá)異常，二者可作為腫瘤診斷的有效指標(biāo)[10-11]。Keller 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞miR-378 表達(dá)升高，靶向抑制miR-216b 表達(dá)，進(jìn)而增加細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC 患者血清miR-378 高于對照組，miR-216b 低于對照組；血清miR-378 和miR-216b 診斷早期NSCLC 的曲線下面積為0.874 和0.845，表明肺癌的發(fā)生會(huì)引起機(jī)體血清miR-378 高表達(dá)和miR-216b 低表達(dá)，因此miR-378 和miR-216b 異常表達(dá)可能與肺癌發(fā)生相關(guān)，有望作為診斷NSCLC 的生物標(biāo)志物。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)手術(shù)后患者miR-378 降低，miR-216b 升高，表明當(dāng)疾病終止時(shí)，患者血清miR-378 和miR-216b 趨向正常，進(jìn)一步說明miR-378 和miR-216b 與肺癌發(fā)展密切相關(guān)，也提示miR-378 和miR-216b 有成為肺癌治療靶點(diǎn)的可能性。

已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-378 和miR-216b 對腫瘤細(xì)胞分化、增殖及轉(zhuǎn)移均有調(diào)控作用[13]。miR-378 高表達(dá)可作用于抑癌基因的上游靶位點(diǎn)，從而抑制抑癌基因表達(dá)，為腫瘤細(xì)胞的增殖和分化提供良好的體內(nèi)環(huán)境基礎(chǔ)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤分期越高、淋巴轉(zhuǎn)移和腫瘤直徑≥3cm 的NSCLC 患者血清miR-378水平增高，miR-216b 水平降低，這表明miR-378 和miR-216b 表達(dá)水平與患者疾病進(jìn)程密切相關(guān)，進(jìn)一步說明miR-378 和miR-216b 可作為NSCLC 診斷生物標(biāo)志物。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-378 高水平組和miR-216b 低水平組患者術(shù)后2 年生存率顯著降低，表明二者對患者術(shù)后康復(fù)情況具有一定的影響；結(jié)合多因 素Cox 回歸分析，miR-378 ＞8.13 和miR-216b＜3.61 為早期NSCLC 患者預(yù)后危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步表明miR-216b 高表達(dá)和miR-216b 低表達(dá)可能不利于NSCLC 患者預(yù)后。然而本研究存在一定局限性，后續(xù)研究中將通過基因敲除技術(shù)進(jìn)一步探討miR-378 和miR-216b 的相互聯(lián)系，同時(shí)加大樣本量的收集以確保研究結(jié)果的可靠性。

綜上所述，在早期NSCLC 患者血清中，miR-378表達(dá)升高，miR-216b 表達(dá)降低。miR-378 高表達(dá)和miR-216b 低表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致NSCLC 患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)增加，降低患者術(shù)后生存率，二者具有成為臨床肺癌治療靶點(diǎn)的潛質(zhì)。