尹 劍 金許洪 呂慶平 張子彬 龐曉俊

自發(fā)性腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是我國最常見的破壞性腦血管疾病，具有很高的死亡率和致殘率。ICH 引起的腦水腫、神經(jīng)炎癥、鐵超載、血腦屏障破壞、細胞凋亡、自噬等病理生理機制復雜，治療措施有限，療效不佳[1-2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡受體抑制劑1（necrostain 1，NEC-1）與腦水腫關系密切，在腦挫傷研究中能減輕神經(jīng)損傷程度[3]。但NEC-1 與ICH 后腦組織交互受體蛋白1/3（receptorinteracting protein 1/3，RIP1/RIP3）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）因子表達之間的關系尚未明確。本實驗制作大鼠腦出血模型，探討NEC-1 在ICH 后繼發(fā)性腦損傷中的作用及具體機制。

1 資料與方法

1.1實驗動物 選擇SPF 級SD 大鼠54 只，體質量250～300g，來源于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗室。所有大鼠飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內，溫度20～26℃，濕度（50%～70%），光照（每12h 明暗交替），換風（15～20 次/h）。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013-2016，動物飼養(yǎng)許可證號：SYXK（浙）2013-0184，本實驗經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學動物管理與倫理委員會審核通過。

1.2主要試劑及儀器 磷酸鹽緩沖液（pH7.2～7.4，美國Hyclone，SH30256.01，AD22391274），BCA 試劑盒（Solarbio，pc0020，20180328），DAPI（中國碧云天，ZH3201、H762531），ECL 顯影液（Solarbio，PE0010，20181220），RIPA 裂解液（Beyotime，P0013D，10352），PVDF 膜（瑞典GE，106000023，A16954279），Trizol（Sangon Biotech，B548124-0500，E108KA7471），Anti-Rat TNF-α（美國PeproTech，500P72，AD3653623），二抗（美國Abcam，ab150076，GR2356152），NEC-1（美國Abcam，411880，ab141053），Anti-Rat RIP1（美國Cell Signaling，E7G60，53286），Anti-Rat RIP3[（美國Abcam，EPR9516（N）-25，ab240336）]，Anti-Rat IL-1β（美國Abcam，RM1009，ab283818）。電泳儀（天能，EPS300），電泳槽（天能，VE180C），轉膜儀（天能，VE186），立體定向儀（美國Stoelting，51600）。

1.3分組及造模 應用隨機數(shù)字表法將大鼠分為三組：假手術組（sham operation group，sham 組），ICH+生理鹽水組（ICH+normal saline group，ICH+NS 組），腦出血+NEC-1 組（ICH+NEC-1 group，ICH+NEC-1組），每組18 只。在無菌條件下，大鼠以3.6%水合氯醛（4g/kg）腹腔麻醉。頭部去毛，俯臥固定大鼠于動物頭顱立體定位儀，調節(jié)立體定位儀，將門齒固定，使前后囟在一條線上，頭皮丁字切開，在人字縫前方2mm、中線旁開2.5mm 處，骨鉆鉆開顱骨約1mm 小孔，不傷及硬腦膜及腦組織。用40℃溫水加熱消毒尾靜脈，待充血充分后消毒，使用微量注射器抽取不抗凝動脈血50μL 固定在定位以上，將微量注射器通過孔洞進針至6mm 尾狀核部，停留時間約5min 后緩慢退出注射器，完善止血后用骨蠟封閉骨窗?？p合皮膚后回籠飼養(yǎng)。Sham 組僅切開頭皮，開骨窗，不造成腦出血。模型制作成功的評分判斷：待大鼠清醒后按照Bederson 評分法[4]分為3 級，Ⅰ級：將大鼠尾巴提起，癱瘓側前肢回收后屈曲于腹下，正常側前肢向地面伸展。Ⅱ級：除Ⅰ級體征外，向癱瘓側推大鼠時阻力較對側明顯降低。Ⅲ級：除以上體征外，大鼠有向癱瘓側側旋的行為。ICH+NS 組以及ICH+NEC-1 組選擇蘇醒后出現(xiàn)上述癥狀和體征的大鼠，而且造模后各時間段均出現(xiàn)相似的神經(jīng)功能缺損癥狀和體征的大鼠為腦出血模型成功者，進行后續(xù)實驗，否則棄之不用。Sham 組大鼠不出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，活動正常。如有造模不成功或死亡，則隨機補充。

1.4側腦室給藥干預方法 大鼠于制作模型成功為起點，Sham 組不給藥；ICH+NS 組經(jīng)側腦室干預注射NS 1μL，ICH+NEC-1 組經(jīng)側腦室干預注射NEC-1溶劑（80μmol/mL）1μL。

1.5大腦組織含水量（brain water content，BWC）測定 分別隨機取Sham 組、ICH+NS 組、ICH+NEC-1組大鼠各6 只，在干預給藥后24h 進行大鼠深麻醉后斷頸處死，并迅速取出腦組織，分別用電子分析天平稱量各只大鼠腦組織濕重，再置入105℃烤箱72h后取出，分別測量大腦組織干重。按照Elliot 公式[5]計算腦組織含水量=（濕重－干重）/濕重×100%。

1.6細胞凋亡的形態(tài)學檢測方法（TUNEL）測定 給藥后24h，分別隨機取Sham 組、ICH+NS 組、ICH+NEC-1 組大鼠各6 只，應用TUNEL 法檢測腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況。具體方法：各取切片，水浴鍋加熱抗原修復，投膜，加入抗體，PBS 清洗，DAPI 核染色，封片。采用灰度值（OD）測量，顯微鏡下觀察并計算神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)。

1.7蛋白質免疫印跡法（Western blot）測定 給藥后24h，分別隨機取Sham 組、ICH+NS 組、ICH+NEC-1 組大鼠各6 只，大鼠提取腦組織，采用Western blot法檢測腦組織中RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β 蛋白水平的表達情況。具體方法：各取適量腦組織加裂解液，勻漿后離心，取上清液，提取蛋白，用BAC 法測定蛋白濃度：放入100℃水浴鍋內煮5min，配置10%SDA-PAG 凝膠，每孔加入適量蛋白和Loading Buffer 混合液，電泳分離，然后將目標蛋白和GAPDH膠轉膜至PVDF 膜上，封閉1h，加入RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β 抗體稀釋液，4℃過夜，再加入二抗，溫室孵育1h，洗膜，用ECL 發(fā)光液顯影。通過應用軟件測OD，以目的蛋白和GAPDH 比值作為相對表達量進行結果分析。

1.8統(tǒng)計學方法 應用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)采用正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用完全隨機設計單因素方差分析（one-way ANVOVA），以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1NEC-1 對ICH 大鼠腦水腫的影響 與Sham 組比較，ICH+NS 組和ICH+NEC-1 組大鼠腦組織含水量顯著升高（P＜0.05）。與ICH+NS 組比較，ICH+NEC-1 組大鼠腦組織含水量減輕（P＜0.05）。見表1。

2.2NEC-1 對ICH 大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)的影響 與Sham 組比較，ICH+NS 組和ICH+NEC-1組凋亡指數(shù)均明顯升高（P＜0.05）。與ICH+NS 組比較，ICH+NEC-1 組神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)顯著減少（P＜0.05）。見表1。

表1 NEC-1 對ICH 大鼠腦組織水腫及神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)的影響（）

表1 NEC-1 對ICH 大鼠腦組織水腫及神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)的影響（）

注：Sham 組為假手術組；ICH+NS 組為模型組，經(jīng)側腦室干預注射NS；ICH+NEC-1 組為模型干預組，經(jīng)側腦室干預注射NEC-1 溶劑；ICH 為自發(fā)性腦出血；NS 為生理鹽水；NEC-1 為壞死性凋亡因子-1；與Sham 組比較，aP＜0.05；與ICH+NS 組比較，bP＜0.05

2.3NEC-1 對ICH 大鼠腦組織RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β 蛋白表達的影響 與Sham 組比較，ICH+NS組和ICH+NEC-1 組RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β 蛋白表達均明顯升高（P＜0.05）。與ICH+NS 組比較，ICH+NEC-1 組RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β 蛋白表達顯著減少（P＜0.05）。見圖1、表2。

表2 NEC-1 對ICH 大鼠腦組織RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β蛋白表達的影響（）

表2 NEC-1 對ICH 大鼠腦組織RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β蛋白表達的影響（）

注：Sham 組為假手術組；ICH+NS 組為模型組，經(jīng)側腦室干預注射NS；ICH+NEC-1 組為模型干預組，經(jīng)側腦室干預注射NEC-1 溶劑；ICH 為自發(fā)性腦出血；NS 為生理鹽水；NEC-1 為壞死性凋亡因子-1；與Sham 組比較，aP＜0.05；與ICH+NS 組比較，bP＜0.05；RIP1 為交互受體蛋白1；RIP3 為交互受體蛋白3；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-1β為白介素-1β

圖1 NEC-1 對ICH 大鼠腦組織RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β蛋白表達的影響

3 討論

ICH 是常見的神經(jīng)外科危急重癥，ICH 后繼發(fā)性腦損傷可誘發(fā)腦疝，危及患者生命。因此，如何有效控制繼發(fā)性腦損傷是改善ICH 患者預后的關鍵。目前，除了開顱清血腫、去骨瓣減壓手術等治療外，臨床上主要采用藥物治療，但療效不佳[6-7]。

交互受體蛋白家族（receptor-interacting proteinfamily，RIPs）是一類具有特異的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白，在免疫、炎癥反應、細胞死亡等信號傳導中發(fā)揮著重要作用。在RIPs 中，RIP1 和RIP3 在細胞壞死性凋亡通路中起到非常重要的作用。其中，RIP1 決定細胞生存或死亡，RIP3 是誘導細胞凋亡與壞死相互轉換的關鍵分子。RIP3 與RIP1 通過共有的同型互動域結構相互作用，使RIP1 磷酸化，形成Necrosis 誘導復合物[8-9]。通過RIP1/RIP3 復合體啟動下游的壞死性凋亡和炎性反應，復合體啟動因子TNF-α 及促神經(jīng)炎癥因子IL-1β 的表達也明顯升高[10]。NEC-1 是RIP1 介導的NEC 特異抑制物，可抑制RIP3 表達，具有保護中樞神經(jīng)細胞的作用，能減輕心腦血管缺血缺氧和缺血-再灌注的損傷程度[11-12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，通過NEC-1 抑制RIP3 與RIP1 啟動的壞死性凋亡能明顯改善神經(jīng)功能癥狀[3]。本實驗通過建立大鼠腦出血模型，經(jīng)側腦室給藥NEC-1 干預后，腦組織中RIP1/RIP3、TNF-α 及IL-1β 表達明顯下調，明顯改善損傷皮質區(qū)神經(jīng)元和星形膠質細胞狀態(tài)，減輕腦水腫，減少神經(jīng)細胞凋亡，進一步發(fā)揮重要的神經(jīng)保護作用。

綜上所述，NEC-1 通過抑制以RIP1/RIP3 為關鍵元件的下游因子，抑制TNF-α 及IL-1β 的表達，進一步減少神經(jīng)細胞凋亡，具有顯著的保護作用，為腦出血后繼發(fā)性腦損傷的治療提供了新的思路。