何 穎 譯自Frontiers in Imunolgy,Vol.9(2018))

李 紅 審 潘雪男 復(fù)審

1 牛奶和乳清蛋白粉中的晚期糖基化終產(chǎn)物

乳制品行業(yè)會在生產(chǎn)中產(chǎn)生大量的液態(tài)奶酪乳清，這些乳清加工后可以生產(chǎn)出各種乳清產(chǎn)品，包括濃縮乳清蛋白、分離乳清蛋白和多種單獨的乳清蛋白。這些加工過的乳清產(chǎn)品可廣泛用作動物飼料的添加劑，用于母豬和新生仔豬、幼齡反芻動物(犢牛)、狗、貓、家禽和水產(chǎn)動物的飼料。在養(yǎng)豬業(yè)，仔豬早期斷奶已成為提高豬場生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益的常規(guī)做法。食物由母乳向固態(tài)飼料的突然轉(zhuǎn)變，飼養(yǎng)環(huán)境的改變，都會給仔豬及其健康帶來巨大的挑戰(zhàn)。為了盡量減少由此產(chǎn)生的應(yīng)激，越來越多的豬場會使用代乳料來穩(wěn)定仔豬腸道微生物菌群，防止腸道發(fā)生功能性紊亂，從而提高仔豬的生長性能。牛奶由于含有均衡的營養(yǎng)成分而成為新生仔豬合適的飼料。作為奶酪制造行業(yè)的一種副產(chǎn)物，奶牛業(yè)甚至還將乳清蛋白喂給奶牛。目前已經(jīng)應(yīng)用的產(chǎn)品包括液態(tài)、固態(tài)或者濃縮乳清及其衍生物。此外，家禽業(yè)也在家禽飼料中添加乳糖和乳清粉。由于不能分泌乳糖酶，家禽并不能通過腸道完全吸收乳糖。相反，乳糖發(fā)酵會產(chǎn)生乳酸和揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)，這些產(chǎn)物能促使乳酸桿菌在雞腸道中定植。腸道中高濃度的VFA被認為有益于家禽的健康，因為它們能夠降低盲腸內(nèi)環(huán)境的pH，并會改變氧化還原電位，兩者聯(lián)合作用能夠抑制潛在病原菌的生長。因此，在日糧中添加乳清蛋白粉是提高肉雞生產(chǎn)力的一種有效方法。

在熱加工過程中，高溫會使牛奶和其他乳制品中的乳清蛋白、糖發(fā)生糖基化，并產(chǎn)生晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)。在牛奶中，乳清蛋白是受熱后最易被破壞的蛋白質(zhì)，并且易發(fā)生糖基化。密集的加熱已經(jīng)被證實能夠促進乳清發(fā)生美拉德反應(yīng)，并形成相應(yīng)的產(chǎn)物。在較低水活度(aw=0.23)條件下進行密集的干燥加熱，乳清蛋白會出現(xiàn)聚集，并發(fā)生美拉德反應(yīng)。此外，干燥加熱不僅會促使乳清蛋白發(fā)生聚集，還會形成與可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物(soluble receptor for advanced glycation endproducts,sRAGEs)結(jié)合的配體，后者會影響食品化合物的免疫原性。RAGEs被認為是與動物先天性免疫相關(guān)的一種模式識別受體，主要識別蛋白質(zhì)構(gòu)象(二級結(jié)構(gòu))，例如β-折疊和纖維樣蛋白，而不是蛋白質(zhì)的主要氨基酸序列(一級結(jié)構(gòu))。這表明加熱可能會誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成更多的β-折疊，促使乳清蛋白聚集，同時與sRAGEs結(jié)合。加熱過程中蛋白質(zhì)變性的影響對乳清蛋白而言是眾所周知的。因此，研究這些AGEs修飾態(tài)蛋白和免疫細胞受體(作為一個重要的接觸互作點)之間的互作似乎是值得的。

2 寵物食品中的AGEs

在大多數(shù)情況下，寵物(包括狗和貓)在其一生中會被喂給經(jīng)過高度加工后的商業(yè)性寵物食品。這些食品的加工主要依賴于熱處理(例如膨化、殺菌、干燥)，以提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率、保質(zhì)期和安全性。熱處理后，寵物食品中的活性賴氨酸比例平均占總賴氨酸含量的73%(范圍39%～100%)，而在生長期狗的日糧中添加的賴氨酸數(shù)量可能低于動物營養(yǎng)需要量的推薦值。因此，與長期食用這些加工食品的健康狗(對照組狗)相比，患糖尿病和腎功能損傷的狗。

用于配制寵物食品的原料和加工方法是影響終產(chǎn)品中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products，MRPs)濃度的關(guān)鍵因素。平均而言，如果以干物質(zhì)計，罐頭食品中MRPs和AGEs的總濃度要高于顆粒食品和膨化食品中的。van Rooijen等研究發(fā)現(xiàn)，商業(yè)性寵物食品中N-羧甲基賴氨酸[N-(carboxymethyl) lysine，CML]和羥甲基 糠 醛 (hydroxymethylfurfural，HMF)的平均含量介于報道的人類加工食品中的含量范圍。但是，狗和貓對HMF的平均日攝入量分別為成年人平均日攝入量的122倍和38倍，而對CML的平均日攝入量與成人的相當(dāng)。該研究還強調(diào)了測定狗生長期斷奶日糧中活性賴氨酸含量的重要性。

重要的問題仍然是在已報道的寵物食品中MRPs和AGEs的含量是否會影響動物的生理活動，這在一定程度上取決于這些MRPs的生物利用率。觀察表明，隨著貓增加采食量，其尿液中MRPs的濃度增加，這說明日糧中的MRPs被成年貓的胃腸道吸收，并隨尿液排出。研究還發(fā)現(xiàn)，隨著貓采食量增加，其泌尿功能恢復(fù)受阻，表明MRP是貓消化、吸收、代謝或者排尿的一個限制因素。到目前為止，還沒有研究報道這種能被吸收的日糧MRPs是否會對寵物的健康產(chǎn)生長期的影響。

3 豬日糧中的AGEs

蛋白質(zhì)是豬日糧中主要的營養(yǎng)物質(zhì)，因此，了解動物對蛋白質(zhì)的吸收和利用對養(yǎng)豬生產(chǎn)及行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。儲存和加工，尤其是加工條件，在很大程度上決定了主要飼料原料的營養(yǎng)價值，這很可能取決于導(dǎo)致MRPs形成的加熱過程中溫度和濕度這兩個參數(shù)的聯(lián)合作用。飼料原料生產(chǎn)商常用多種不同加工方式處理豬日糧的原料(例如豆粕、干酒糟及其可溶性物、玉米、玉米蛋白粉)。在生產(chǎn)油籽原料(豆粕、菜籽粕、葵花籽粕和棉籽粕)時，通常需要采用熱加工工藝來提高營養(yǎng)價值，以去除油脂提取過程中所使用的萃取劑。這些步驟包含了不同程度的熱處理對蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的影響，尤其是采用高溫處理工藝時。正如上述所討論的賴氨酸——豬日糧營養(yǎng)成分中第一限制性氨基酸——是美拉德反應(yīng)(Maillard reaction，MR)中活性最大的氨基酸。因此，賴氨酸通常會被以晶體態(tài)的形式加入豬日糧中，以確保吸收的氨基酸和可用的氨基酸的平衡與蛋白質(zhì)合成的需求完全一致，確保動物獲得最佳生產(chǎn)性能。

4 牛飼料中的AGEs

奶牛場通常會定期給奶牛飼喂?jié)饪s料，濃縮料含有熱加工產(chǎn)生的MRP和AGEs，而這些化合物能在牛奶中被檢測出。有機飼養(yǎng)的奶牛只喂給未經(jīng)熱加工的日糧，例如青草或青貯飼料。因此，有機牛奶含有較低水平的糖基化蛋白，其含量和組分能被檢測。飼料中的MRP(如吡咯素)可以在血液凈化時形成的尿液中被檢測到，因此可以預(yù)測奶牛在哺乳期能夠?qū)GEs分泌至牛奶中，隨后哺乳給新生牛犢。在過去數(shù)十年中，奶牛的產(chǎn)奶量有了顯著提高，與奶牛的天然食物原料相比，奶牛需要更高水平的能量和氮。因此，在奶牛生產(chǎn)中，奶牛場越來越多地給奶牛飼喂加工過的糖蜜、豆粕和菜籽粕，與此同時伴隨著可能會提高奶牛攝入高水平MRP的風(fēng)險。飼料中的MRP能夠影響奶牛瘤胃中的微生物組成。此外，用來配制奶牛日糧的粗飼料往往具有很低的消化率，因此，為確保乳制品的生產(chǎn)率，奶牛場有必要給奶牛飼喂可以被吸收的含有MRP的濃縮飼料。使用水解和熱誘導(dǎo)糖基化加工的牛奶蛋白表現(xiàn)出抗氧化和抗炎活性，從而提高其功能性。生的牛肉和豬肉天生含有一小部分的蛋白態(tài)AGEs(protein-bound AGEs)，而生的雞胸脯肉含有更高水平的此類AGEs。因此，在牛肉中，蛋白含量不會顯著影響蛋白態(tài)AGEs的總水平。商用加工方法將在很大程度上決定蛋白態(tài)AGEs的總含量。

5 AGEs和奶牛跛行

在世界各地的奶牛場，奶牛跛行(蹄葉炎)是最突出、最嚴重的動物健康和福利問題之一，該病主要由蹄部損傷或發(fā)生炎性病變造成。飼養(yǎng)地不同，奶牛的跛行發(fā)病率也不相同，通常介于2%～55%；但是，在過去20年中，奶牛的跛行發(fā)病率顯著提高。奶牛跛行除了是生產(chǎn)中一個重要的福利問題之外，還是一個導(dǎo)致產(chǎn)奶量減少、繁殖率降低以及淘汰風(fēng)險提高的重要的經(jīng)濟因素。蹄葉炎被定義為牛蹄的一種真皮彌散性、無菌性炎癥，被認為是引發(fā)跛行的一個重要因素。有證據(jù)證明，與蹄葉炎相關(guān)的蹄損傷包括蹄底和白線出血以及蹄底潰瘍被認為是引發(fā)奶牛跛行的重要因素。引發(fā)蹄葉炎的誘發(fā)因素很多，包括農(nóng)場管理、牛舍條件、品種、育種和營養(yǎng)水平。盡管營養(yǎng)水平與蹄葉炎的發(fā)生有著廣泛的聯(lián)系，但日糧和/或飼養(yǎng)管理的特點以及這些特點如何導(dǎo)致跛行發(fā)生的機制尚未得到充分的研究。

同樣，眾所周知，馬也會發(fā)生蹄葉炎，且肥胖和抗胰島素作用是與蹄葉炎發(fā)生密切相關(guān)的因素。胰島素的作用通過實驗得到了證實，給臨床上正常的馬長期注射胰島素和葡萄糖以使血糖含量維持在生理水平上，結(jié)果誘發(fā)了蹄葉炎。日糧含有AGEs表明其參與了胰島素誘發(fā)蹄葉炎。同樣，有人認為，日糧中的AGEs和抗胰島素作用共同導(dǎo)致牛蹄葉炎。有研究表明，抗胰島素作用通常出現(xiàn)在泌乳早期的奶牛中，如果大量采食快速發(fā)酵的碳水化合物或淀粉，這種情況可能會加劇。有趣的是，泌乳早期也是奶牛蹄葉損傷的高發(fā)階段，例如常常觀察到蹄底和白線出血?？梢哉f，奶牛在泌乳早期發(fā)生蹄葉炎可能與抗胰島素作用和AGEs的產(chǎn)生有關(guān)。

晚期糖基化終產(chǎn)物是由葡萄糖通過乙二醛、3-脫氧葡萄糖酮和甲基乙二醛等中間產(chǎn)物衍生而來的，有學(xué)者推測甲基乙二醛是細胞內(nèi)和血清中AGEs的主要來源。研究表明，在體外環(huán)境中，乙二醛酶Ⅰ和乙二醛酶Ⅱ共同作用將甲基乙二醛轉(zhuǎn)化為D-乳酸鹽，從而阻止AGEs的形成。給牛和馬飼喂大量的可發(fā)酵碳水化合物，會導(dǎo)致瘤胃或盲腸發(fā)生酸中毒，繼而引發(fā)全身性酸中毒，牛血清中的D-乳酸鹽水平可能會提高至25 mMol/L。不幸的是，終產(chǎn)物D-乳酸鹽會對乙二醛酶Ⅰ產(chǎn)生負反饋，但是這可能與蹄葉炎的發(fā)生有關(guān)。除了AGEs可能來自動物中間代謝產(chǎn)生的甲基乙二酸外，甲基乙二酸也可以在快速發(fā)酵的碳水化合物進行厭氧發(fā)酵的過程中形成。前文已經(jīng)提到，在生理條件下甲基乙二醇能夠被轉(zhuǎn)化成D-乳酸鹽。因此，可以推測，在奶牛和馬的實際飼喂條件下，快速發(fā)酵的碳水化合物在發(fā)酵時會導(dǎo)致D-乳酸鹽和甲基乙二醇累積。甲基乙二醇對于細胞是有毒性的，最終會導(dǎo)致細胞裂解，隨后釋放出脂多糖，而這些脂多糖與牛和馬的蹄葉炎有關(guān)。另外，甲基乙二醇可能會被牛和馬的瘤胃上皮細胞吸收，并通過胃腸道上皮細胞隨后激發(fā)AGEs的形成。

6 討論

熱加工會改變食品成分的化學(xué)和物理特性，例如加熱會導(dǎo)致MRPs和AGEs產(chǎn)生。MR態(tài)蛋白質(zhì)是在糖和加熱的共同作用下產(chǎn)生的。這些分子在非均勻混合物中以不同形式存在，正是這些不同的存在形式證明它們具有不同的生物活性。

飼料的成分和配方以及飼料加工工藝決定了動物腸道的健康和對疾病的抵抗力。含有MRP和AGEs的蛋白質(zhì)原料能夠?qū)е聞游锬c道微生物擴張，再與能夠損傷腸道屏障的化合物聚集一起作用，損壞腸上皮細胞的屏障功能，激發(fā)機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，最終導(dǎo)致動物生長變緩、生產(chǎn)性能下降和疾病的暴發(fā)。

采用集約化方式飼養(yǎng)的動物常常會遭受免疫應(yīng)激，連同病原體負載、飼養(yǎng)環(huán)境、飼料組成與生產(chǎn)工藝以及制定的免疫接種程序一起決定動物的免疫狀態(tài)。炎癥的發(fā)生可能與釋放促炎性細胞因子、動員儲備的營養(yǎng)物質(zhì)、抑制腸道吸收營養(yǎng)物質(zhì)以及因利尿和腹瀉等導(dǎo)致體液流失有關(guān)，使動物付出巨大的營養(yǎng)代價。激活獲得性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性抗體，將會消耗相對較少的營養(yǎng)成本。因此，日糧中的免疫調(diào)節(jié)劑和/或疫苗將能夠增強動物機體的免疫應(yīng)答，減少免疫應(yīng)激，促進機體的健康，提高生產(chǎn)性能。

日糧糖基化蛋白(dietary glycated proteins，dAGEs)具有免疫調(diào)節(jié)功能。大量的證據(jù)表明這些糖基化蛋白與動物的許多慢性疾病有關(guān)，這些慢性疾病主要由細胞和組織中AGEs調(diào)控蛋白的累積而引發(fā)。AGEs和APCs(包括巨噬細胞和樹突狀細胞)之間的相互作用可能是引發(fā)這種免疫刺激的潛在機制。這些細胞的細胞膜上的模式識別受體能夠識別經(jīng)過修飾的蛋白，形成復(fù)合物，并開始向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，最終激活k 基因結(jié)合核因子(nuclear factor-k-gene binding，NF-kB)轉(zhuǎn)錄因子，產(chǎn)生促炎性細胞因子，并誘發(fā)氧化應(yīng)激。此外，由于巨噬細胞和樹突狀細胞屬于APCs，由處理后的抗原衍生出的多肽將被遞呈至MHC-Ⅱ分子上的CD4+T細胞。遞呈的抗原和分泌的細胞因子聯(lián)合作用將激活T細胞，并誘發(fā)細胞反應(yīng)，如果刺激持續(xù)存在或抑制機制不能有效解決平衡問題，就會產(chǎn)生慢性炎癥狀態(tài)。

由于美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的AGEs具有多樣性，許多細胞受體對這些AGEs具有結(jié)合親和力。在這些受體中，RAGEs是被討論和研究最多的一個受體，sRAGEs是RAGEs的可溶性變體。存在于RAGEs上，而不是sRAGEs上的跨膜和細胞內(nèi)信號域，對將信號傳遞至細胞核并激活NF-kB至關(guān)重要。由于sRAGEs仍然攜帶配體結(jié)合域(V結(jié)構(gòu)域)，它對AGEs修飾的蛋白態(tài)具有與RAGEs本身相似的結(jié)合親和力。在體內(nèi)試驗中，sRAGEs起著誘導(dǎo)作用，并與循環(huán)中的AGEs結(jié)合，隨后調(diào)控與細胞膜相關(guān)的RAGEs和AGEs之間的互作。血清中的sRAGEs和AGEs之間的相互作用可以降低不良炎性應(yīng)答的風(fēng)險，因為與RAGEs不同，這些合成物被認為能被降解。事實上，據(jù)報道慢性炎癥患者血清中sRAGEs的水平較低。與RAGEs一樣，半乳糖凝集素-3能夠與AGEs相互作用，有助于隨后的細胞信號傳遞，同樣有助于攝取這些經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)。

由于這種受體缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域，半乳糖凝集素-3會連接其他AGEs-R膜受體復(fù)合物，即AGEs-R1/OST-48和AGEs-R/80K-H。半乳糖凝集素-3上的碳水化合物識別域?qū)θ樘怯杏H和力，這似乎可以解釋其與食品或者飼料源AGEs之間存在潛在的相互作用。激活半乳糖凝集素-3能夠改變生物學(xué)過程，包括免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。此外，Ⅰ型A 類清道夫受體(scavenger receptor class A1，SR-AⅠ)和Ⅲ型B類清道夫受體(scavenger receptor class B3，SR-BⅢ)[分化抗原簇36( cluster of differentiation，CD36)是巨噬細胞清除受體家族的兩個成員，能夠結(jié)合糖基化蛋白。這兩個受體主要推動AGEs的內(nèi)吞作用，并且在巨噬細胞上大量表達。這些受體與AGEs相互作用后的細胞反應(yīng)涉及多種功能，包括免疫(過敏或/和炎癥)應(yīng)答。

正如前文所述，RAGEs是公認的AGEs的受體，現(xiàn)有的大多數(shù)研究都集中探討這個受體的功能。RAGEs的結(jié)構(gòu)對其發(fā)揮生物學(xué)活性至關(guān)重要，這一組合的任何修改都會導(dǎo)致功能的改變。高溫加熱使RAGEs二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)中的氫鍵和極性疏水的相互作用失真，因此，α-螺旋和β-折疊遭到破壞，并且該蛋白分子的自然折疊和三級結(jié)構(gòu)功能喪失。此外，變性的蛋白質(zhì)會發(fā)生交互聯(lián)結(jié)，并凝聚在一起。兩個或多個變性的蛋白分子相互間共價結(jié)合，形成新的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)很可能無法匹配任何親本分子的特征。這些新的蛋白分子通常體積龐大，構(gòu)象表位發(fā)生改變，可能會被細胞受體識別。Liu等研究表明RAGEs的結(jié)合與乳清蛋白的聚集有關(guān)。總之，與未進行加熱處理的樣品相比，加熱處理后的糖基化蛋白在構(gòu)象上發(fā)生了改變，同時對受體結(jié)合變得更有力，RAGEs受體結(jié)合能力更強。綜上所述，糖基化蛋白對sRAGEs、CD36、SR-AI和半乳糖凝集素-3具有更高的結(jié)合親和力。

7 總結(jié)

綜上所述，在食品和飼料的熱加工過程中，蛋白質(zhì)會發(fā)生變性、糖基化以及凝聚。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的這些改變提高了它們對抗原遞呈細胞上細胞受體，即sRAGEs、CD36、SR-AI和半乳糖凝集素-3的親和力。雖然加熱處理后的蛋白質(zhì)和糖基化蛋白均具有較強的受體結(jié)合親和力，但是糖基化的效果通常明顯高于熱處理的效果。盡管已經(jīng)證實，MR通過破壞氨基酸和礦物質(zhì)的生物利用率，降低蛋白質(zhì)消化率，并提高蛋白質(zhì)免疫反應(yīng)性來影響蛋白質(zhì)的質(zhì)量，但是為了動物的健康、福利、生長和生產(chǎn)性能，迫切需要更多關(guān)于動物食用富含MRPs的日糧對其生理和免疫影響的信息。

原 題 名：Immunomodulation by processed animal feed: the role of Maillard reaction products and advanced glycation end-products (AGEs)(英文)

原 作 者：Malgorzata Teodorowicz、Wouter H Hendriks、Harry J Wichers和Huub F J Savelkoul