孫炳新 于官楚 任 浩 唐建新

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 遼寧 沈陽 110866

0 引言

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）又名白蘑菇或紐扣蘑菇，具有豐富的食用價值和藥用價值[1-3]，是目前唯一全球性栽培的食用菌，產(chǎn)量占食用菌總量的30%，備受國內(nèi)外消費者青睞[4-5]。雙孢蘑菇主要以鮮食為主，然而因其具有呼吸旺盛、含水量高和易受機械損傷等特點，子實體在采后極易失水、開傘和褐變，給蘑菇的貯運帶來了困難[6]。此外，在運輸過程中車輛的振動頻率約為2～5 Hz[7]，會使雙孢蘑菇不斷受到振動脅迫，加速了蘑菇褐變、損傷等品質(zhì)劣變，嚴(yán)重影響雙孢蘑菇的貨架期和商品價值。

目前已有研究[8-14]表明，振動可對梨、藍莓、獼猴桃、杏、蘋果、蒜薹、桃等果蔬品質(zhì)產(chǎn)生不同程度的損傷。許時星等[9]探究了不同振動時間處理對藍莓果實品質(zhì)和抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)振動對果蔬的損傷不是瞬時形成的，而是逐漸累積的。S.Chaiwong 等[15]分別在3, 4, 5 Hz 振動頻率下對草莓進行了50, 150 s的振動試驗。結(jié)果表明，草莓在5 Hz、150 s的振動水平下顯示出更嚴(yán)重的擦傷和更大的電導(dǎo)率值。胡云峰等[13]發(fā)現(xiàn)振動處理后蒜薹的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量升高，誘導(dǎo)過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbateperoxidase，APX）活性升高。

盡管國內(nèi)外學(xué)者圍繞果蔬貯運問題已展開大量的研究，然而振動脅迫對雙孢蘑菇貯藏期間品質(zhì)和采后生理相關(guān)的研究還未見報道。鑒于此，本實驗研究了不同振動時間對雙孢蘑菇貯藏期間的活性氧自由基、抗氧化物質(zhì)、抗氧化酶活性、細胞膜透性及雙孢蘑菇顏色的影響，旨在為雙孢蘑菇物流保鮮技術(shù)的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 試驗

1.1 材料與試劑

選擇外表潔白、菌蓋直徑為3～4 cm、無損傷、無畸形、未開傘的新鮮雙孢蘑菇為試驗樣品；BOPP（聚丙烯）托盒尺寸為223 mm×133 mm×40 mm；PA/PE（聚酰胺/聚乙烯）復(fù)合膜的厚度為 69.2 μm，透氧率為68.218 cm3/(m2·24 h·0.1 MPa)，CO2的 透 過 率 為 30.645 cm3/(m2·24 h·0.1 MPa)，透濕率為 5.55 g/(m2·24 h)。

O2-、H2O2、SOD和CAT 試劑盒，南京建成生物工程研究所；三氯乙酸、抗壞血酸、愈創(chuàng)木酚、2, 6-二氯靛酚，均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；2-硫代巴比妥酸，分析純，上海瑞永生物科技有限公司；鄰苯二酚，分析純，沈陽瑞豐精細化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺式微量高速離心機，H1650-W/H1650W型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；高速低溫離心機，CR21N型，日本日立集團；電導(dǎo)率儀，DDS-11A型，上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司；紫外分光光度計，UV-1800型，日本島津公司；水浴鍋，HWS28型，上海一恒科技有限公司；酶標(biāo)儀，Eon型，美國BioTek公司；色差儀，CM-2300d型，柯尼卡美能達；低溫恒溫培養(yǎng)箱，MIR-254-PC型，日本松下公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

試驗樣品分為3組，每組約為2 kg，裝入泡沫箱中（尺寸：26 cm×13 cm×15 cm）。將樣品置于模擬運輸振動臺，設(shè)定振動速率為180 r/min（3 Hz），振動時間分別為1 h和2 h，并以未經(jīng)振動的雙孢蘑菇作對照。振動結(jié)束后，取約120 g雙孢蘑菇置于BOPP托盒中，用PA/PE復(fù)合膜封裝（在薄膜中心位置做扎孔處理，孔徑為0.5 mm）后放入3 ℃的低溫培養(yǎng)箱中貯藏，每組樣品處理設(shè)3個平行試驗。

2）H2O2含量的測定：稱取約0.1 g組織，加入1 mL丙酮，進行冰浴勻漿；4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，取上清液，冰浴待測；向EP管中加入上清液與試劑，充分混勻，25 ℃、12 000 r/min下離心10 min，棄上清液，留沉淀；加入試劑溶解沉淀后混勻，12 000 r/min離心2 min，于415 nm處測定吸光度值。

1.3.3 總酚和類黃酮含量的測定

參照Zhou Y.H.等[16]的方法，稱取2 g雙孢蘑菇，加4 mL預(yù)冷的體積分數(shù)為1 %鹽酸-甲醇溶液，冰浴勻漿后轉(zhuǎn)移至25 mL試管，再加1 %鹽酸-甲醇溶液至20 mL，于4 ℃避光提取1 h，期間多次振蕩；然后在4 ℃、12 000 r/min下離心20 min，所得的上清液即為總酚和類黃酮提取液。用酶標(biāo)儀分別測定所得樣品在280 nm和325 nm處的吸光度值，結(jié)果以每克鮮重（fresh weight，F(xiàn)W）樣品在波長280 nm和325 nm處吸光度值作為總酚和類黃酮的相對含量。

1.3.4 抗壞血酸含量的測定

參照K.K.Mishra等[17]的2，6-二氯靛酚法，配制L-抗壞血酸（L-ascorbic acid，AsA）標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為0～100 μg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.003x-0.0028（R2=0.9965）計算出雙孢蘑菇中AsA的含量。

1.3.5 SOD和CAT活性的測定

1）SOD活性的測定：稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液，進行冰浴勻漿；4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，取上清液，冰浴待測；向EP管中加入上清液與試劑充分混勻，室溫避光靜置30 min后，于450 nm處測定吸光度值。

2）CAT活性的測定：稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液，進行冰浴勻漿；4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，取上清液，冰浴待測；向EP管中加入上清液與試劑，混勻，室溫25 ℃下反應(yīng)5 min，取混合溶液加入試劑，混勻，室溫25 ℃下反應(yīng)5 min，于510 nm處測定吸光度值。

1.3.6 APX活性的測定

稱取2 g雙孢蘑菇，加入5 mL 0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH= 7.5，含質(zhì)量分數(shù)為2 %的聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP）），在冰浴條件下勻漿，于4 ℃、12 000 r/min下離心30 min，收集上清液即為酶提取液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

活性測定：參照文獻[18]中方法，以每克鮮重（FW）樣品每分鐘吸光度變化0.01為酶活力的1個單位（U/(min·g)）。

1.3.7 多酚氧化酶活性的測定

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）提取方法同POD酶，參照文獻[18]中方法，以每分鐘吸光度變化1為酶活力的1個單位（U/(min·g)）。

1.3.8 MDA含量和相對電導(dǎo)率的測定

MDA含量采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法[19]測定。相對電導(dǎo)率測定：切取6片大小一致的雙孢菇肉，用去離子水沖洗3次，加40 mL去離子水并振蕩30 min，測定初始電導(dǎo)率（σ0），然后沸水浴10 min（透氣過濾封口膜封口），冷卻至室溫后測電導(dǎo)率（σ1），則相對電導(dǎo)率（σ′）為

1.3.9 色澤

使用色差計測定雙孢蘑菇菌蓋的L*、a*、b*值。其中L*值反映雙孢蘑菇的亮度，數(shù)值越大表示亮度越高；a*值反映雙孢蘑菇的紅綠度，正值代表偏紅，負值代表偏綠；b*值反映雙孢蘑菇的黃藍度，正值代表偏黃，負值代表偏藍。每組隨機選取5個雙孢蘑菇，在菌蓋隨機取3個點進行測定取平均值。以褐變指數(shù)（browning index，BI）表征蘑菇菌蓋的顏色變化[20]：

調(diào)查中發(fā)現(xiàn)快遞不快以及不予送貨上門的問題十分突出。在北京市消協(xié)和市工商局12315指揮中心受理的快遞投訴中約占3成多?？蛻暨x擇物流公司的首要優(yōu)勢就是物流快速及時方便，然而一些快遞公司允諾一兩天內(nèi)到達的貨物往往要拖上幾天。延誤或者晚點會對于有些客戶而言，可能會造成嚴(yán)重損失，影響客戶體驗。如北京市消費者張女士委托某快遞公司快遞戶口本從臨沭至北京，快遞公司承諾3日內(nèi)送到，但消費者等了8天也沒收到。

其中

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，運用Duncan多重比較法對差異顯著性（p＜ 0.05）進行比較分析，使用Origin 9.1軟件對數(shù)據(jù)進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 振動脅迫對雙孢蘑菇產(chǎn)生O2-活力和H2O2含量的影響

為了研究振動脅迫對雙孢蘑菇品質(zhì)的影響，將樣品置于模擬運輸振動臺，振動時間分別為1, 2 h，并以未經(jīng)振動的雙孢蘑菇（簡稱CK）作為對照，經(jīng)過一段時間后，雙孢蘑菇產(chǎn)生活力和H2O2含量變化如圖1所示，圖中字母表示同一天內(nèi)不同處理組之間的顯著性（p＜ 0.05，下同）。

圖1 振動脅迫對雙孢蘑菇產(chǎn)生O2-活力和H2O2含量的影響Fig.1 Effects of vibration stress on production O2-activity and H2O2 content of Agaricus bisporus

2.2 振動脅迫對雙孢蘑菇總酚和類黃酮含量的影響

酚類物質(zhì)和類黃酮是雙孢蘑菇中主要的抗氧化成分[22]，這些成分對人體預(yù)防癌癥和心血管疾病等具有積極作用[23]。

模擬振動試驗中，不同振動時間（1, 2 h）及未振動對照組雙孢蘑菇在經(jīng)過一段時間后，總酚和類黃酮的含量變化如圖2所示。

圖2 振動脅迫對雙孢蘑菇總酚和類黃酮含量的影響Fig.2 Effects of vibration stress on total phenolic and flavonoid content of Agaricus bisporus

2.3 振動脅迫對雙孢蘑菇AsA含量的影響

AsA作為植物體內(nèi)重要的非酶類抗氧化物質(zhì)，能夠在逆境脅迫過程中清除植物體內(nèi)過量的活性氧，保護細胞膜結(jié)構(gòu)，并在一定程度上抵抗逆境脅迫，延緩果實衰老[21]。

模擬振動試驗中，不同振動時間（1, 2 h）及未振動對照組雙孢蘑菇在經(jīng)過一段時間后，AsA含量變化如圖3所示。

圖3 振動脅迫對雙孢蘑菇AsA含量的影響Fig.3 Effect of vibration stress on ascorbic acid content of Agaricus bisporus

由圖3可知，雙孢蘑菇的AsA含量在貯藏期內(nèi)總體上呈下降趨勢。新鮮雙孢蘑菇的AsA含量為63.51μg/g，振動處理組蘑菇的AsA含量前4 d急劇下降，第4 d的AsA含量分別是初始值的87.59%（1 h）和84.37%（2 h），而對照組在前4 d下降不明顯。這可能是因為振動脅迫加速了AsA分解，AsA氧化生成羰基化合物，與氨基酸、蛋白質(zhì)等含氮化合物聚合生成有色物質(zhì)，加速褐變[24]。由此推測，抗壞血酸氧化引起的非酶促褐變可能是導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的主要因素之一。

2.4 振動脅迫對雙孢蘑菇抗氧化酶和多酚氧化酶活性的影響

SOD酶、CAT酶和APX酶是抗氧化代謝中重要的活性氧清除酶，對細胞內(nèi)氧化還原平衡起著重要的作用。通過清除組織和細胞中的O2-及其分解產(chǎn)生的H2O2，可減少膜的氧化損傷，達到延緩細胞衰老的目的[9]。PPO酶能催化O2與酚類物質(zhì)反應(yīng)，導(dǎo)致果蔬發(fā)生酶促褐變[25]。

模擬振動試驗中，不同振動時間（1, 2 h）及未振動對照組雙孢蘑菇在經(jīng)過一段時間后，抗氧化酶（SOD酶、CAT酶和APX酶）和多酚氧化酶活性的變化如圖4所示。

圖4 振動脅迫對雙孢蘑菇SOD酶、CAT酶、APX酶和PPO酶活性的影響Fig.4 Effects of vibration stress on SOD, CAT, APX and PPO activity of Agaricus bisporus

由圖4a可知，在振動處理后的前4 d，振動組SOD酶的活性均顯著高于對照組，且2 h振動組的要高于1 h振動組。SOD酶活性在振動脅迫后快速升高，并在第4 d達到峰值，分別為316.45 U/g FW（1 h）和325.54 U/g FW（2 h）。由圖4b可知，CAT酶活性呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，前4 d內(nèi)CAT酶活性雖降低，但振動組仍高于對照組，4 d后對照組CAT酶活性顯著升高，遠超過振動組CAT酶活性。 由圖4c可知，對照組蘑菇的APX酶活性在整個貯藏期間變化幅度較小，但普遍低于振動處理組；振動組APX酶活性分別在第4 d（2 h）和第6 d（1 h）達到峰值，隨后活性下降。以上結(jié)果表明雙孢蘑菇經(jīng)歷振動脅迫后會迅速啟動自由基清除機制，以維持蘑菇活性氧代謝的平衡；隨后活性氧清除能力從第4 d開始逐漸減弱，振動組雙孢蘑菇的活性氧清除能力在后期低于對照組，導(dǎo)致蘑菇膜脂過氧化加速，加劇了細胞膜的氧化損傷。由圖4d可知，總體上振動處理后蘑菇的PPO酶活性高于對照組，尤其是在貯藏前期，2 h振動處理組蘑菇的PPO活性顯著提高。這是由于振動脅迫導(dǎo)致的機械損傷加速了酚類物質(zhì)與PPO酶的反應(yīng)，從而加速雙孢蘑菇的褐變。在貯藏后期，可能由于酚類物質(zhì)的大量消耗，2 h振動處理組蘑菇的PPO活性處于較低水平。

2.5 振動脅迫對雙孢蘑菇MDA含量和相對電導(dǎo)率的影響

振動脅迫導(dǎo)致膜損傷的原因通常與活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過量積累和膜脂過氧化密切相關(guān)。MDA作為多不飽和脂肪酸氧化的產(chǎn)物之一，能加劇細胞膜的損傷，且細胞膜透性與細胞膜的完整程度密切相關(guān)，因此MDA含量和相對電導(dǎo)率可間接反映細胞膜受損的程度[26]。

模擬振動試驗中，不同振動時間（1, 2 h）及未振動對照組雙孢蘑菇在經(jīng)過一段時間后，MDA含量和相對電導(dǎo)率的變化如圖5所示。

圖5 振動脅迫對雙孢蘑菇MDA含量和相對電導(dǎo)率的影響Fig.5 Effects of vibration stress on MDA content and relative electrical conductivity of Agaricus bisporus

由圖5可以看出，蘑菇的MDA含量和相對電導(dǎo)率在貯藏期內(nèi)均呈上升趨勢，且振動處理組顯著性高于對照組（p＜0.05），表明蘑菇在貯藏期內(nèi)細胞膜的損傷隨貯藏時間的延長而加劇，從而導(dǎo)致更多的電解質(zhì)滲漏[27]，這是機械振動造成的典型生理損傷之一，在梨[28]、哈密瓜[29]、草莓[30]等果實的振動研究中也有類似報道。

2.6 振動脅迫對雙孢蘑菇色澤的影響

色澤作為雙孢蘑菇采后最直觀的品質(zhì)參數(shù)，是影響消費者購買行為的重要因素。褐變是振動脅迫后品質(zhì)下降的主要表現(xiàn)之一，可由L*和BI來反映[31]。L*值越低雙孢蘑菇顏色越暗，研究表明當(dāng)雙孢蘑菇的L*值大于80時，是消費者可接受的品質(zhì)[32]。

模擬振動試驗中，不同振動時間（1, 2 h）及未振動對照組雙孢蘑菇在經(jīng)過一段時間后，L*和BI的變化如圖6所示。

圖6 振動脅迫對雙孢蘑菇L*和褐變指數(shù)的影響Fig.6 Effects of vibration stress on L* and browning index of Agaricus bisporus

由圖6可知，振動處理后雙孢蘑菇的亮度值顯著低于對照組，BI值則顯著高于對照組，表明雙孢蘑菇的褐變程度隨振動時間的延長而不斷加劇，這可能與貯藏后期大量活性氧積累，較低的SOD酶、CAT酶活性以及較低的總酚、類黃酮和抗壞血酸含量相關(guān)，導(dǎo)致MDA含量和電導(dǎo)率不斷升高，細胞氧化損傷嚴(yán)重，從而加速雙孢蘑菇褐變。由此推斷，抗氧化酶活性變化是導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的主要原因[24]。

3 結(jié)論

振動脅迫對雙孢蘑菇的色澤及抗氧化性能具有顯著的影響，振動脅迫引發(fā)的氧化應(yīng)激加速了總酚和類黃酮等抗氧化物質(zhì)的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)雙孢蘑菇產(chǎn)生大量的活性氧自由基，伴隨著膜脂過氧化作用逐漸加劇最終導(dǎo)致細胞的氧化損傷。此外，振動脅迫后雙孢蘑菇通過提高抗氧化物酶活性迅速啟動自由基清除機制，以維持蘑菇活性氧代謝的平衡。然而隨著自由基的大量積累，在第4 d后雙孢蘑菇的活性氧清除能力開始逐漸減弱，導(dǎo)致蘑菇膜脂過氧化加速，加劇了細胞膜的氧化損傷。

綜合以上，振動脅迫條件下雙孢蘑菇的活性氧自由基迅速積累，導(dǎo)致細胞膜的氧化損傷加劇，從而加速了雙孢蘑菇的褐變。