曾 金 李 萍 歐人豪 肖 萍

廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院，廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院 兒童醫(yī)院，廣西 柳州 545001

參柏濕疹搽劑由柳州市婦幼保健院皮膚科用于治療皮膚濕疹的經(jīng)驗方開發(fā)而成。由七味中藥組成，包括苦參、黃柏、地榆、紫草、馬齒莧、雷公藤、丹參等，具有清熱燥濕止癢，涼血活血透疹的功效,臨床用于兒童皮膚濕疹具有較好的療效。方中苦參、黃柏清熱燥濕,為主藥，苦參中的主要有效成分苦參堿和氧化苦參堿，黃柏中主要有效成分小檗堿、黃柏堿，具有抗菌、抗炎、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用[1-3]。研究通過對黃柏和苦參進(jìn)行薄層鑒別，同時采用高效液相色譜法對苦參中主要有效成分苦參堿、氧化苦參堿，黃柏中主要有效成分小檗堿和黃柏堿進(jìn)行含量測定，來達(dá)到保證制劑質(zhì)量和療效的目的。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(島津香港有限公司)；FA1004電子分析天秤(上海天平儀器廠)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)；KQ-300DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ZF-1三用紫外分析儀(上海精科實業(yè)有限公司)；DHG-9023AD電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海東麓儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 材料 硅膠板(批號：20181212，青島海洋化工有限公司)；硅膠預(yù)制板G(批號：20130107，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。苦參對照藥材(批號：121019-200705，中國藥品生物制品檢定所)、黃柏對照藥材(批號：121510-201606，中國食品藥品檢定研究院)；黃柏堿對照品(批號：yz180414)、小檗堿對照品(批號：yz180103)、苦參堿對照品(批號：yz170331)、氧化苦參堿對照品(批號：yz170614)均為南京源植生物科技有限公司；參柏濕疹搽劑(每瓶500 mL)由柳州市婦幼保健院藥劑科制劑室提供；乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司) 、甲醇(天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)為色譜純；其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 苦參薄層鑒別 取本品20 mL，加濃氨試液調(diào)pH=9，用三氯甲烷萃取3次(分別為20、15、10 mL)，合并三氯甲烷層，水浴蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取缺苦參的陰性樣品，同法制備得苦參陰性對照品溶液。取苦參對照藥材2 g，加水200 mL煎煮，濾過，濾液濃縮至20 mL，按樣品處理方法制備藥材供試品。精密稱取苦參堿對照品適量，加甲醇制成0.18 mg·mL-1的對照品溶液。

照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版一部附錄VIB)試驗，吸取以上溶液各10 uL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮-乙酸乙酯-濃氨(2∶3∶4∶0.15)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，日光下檢視[1-6]。結(jié)果樣品與對照品和對照藥材在相同位置有橙色斑點，陰性對照無干擾。如圖1所示。

注：1.陰性對照；2.對照藥材；3.苦參堿對照品；4～6.為供試品

2.1.2 黃柏薄層鑒別 取本品50 mL，加熱濃縮至20 mL，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，過濾，濾液蒸干，甲醇2 mL溶解，離心2 min，取上清液作為供試品溶液。另取缺黃柏的陰性樣品，同法制備得黃柏陰性對照溶液。精密稱取黃柏對照藥材0.1 g，置于錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至2 mL，得黃柏對照藥材溶液。精密稱取適量黃柏堿、鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇溶解，制成含量分別為0.24 mg·mL-1、0.23 mg·mL-1的黃柏堿對照品溶液和鹽酸小檗堿對照品溶液。

按薄層色譜法(《中國藥典》2015年版一部附錄VIB)試驗，吸取以上溶液各10 uL分別點于同一硅膠G板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。噴以稀碘化鉍鉀試液，日光下檢視。結(jié)果樣品與對照藥材和對照品在相同位置有橘色斑點，陰性對照無干擾。如圖2所示。

注：1.陰性對照；2、3、4.供試品；5.對照藥材；6.黃柏堿對照品；7.小檗堿對照品

2.2 苦參堿和氧化苦參堿含量測定

2.2.1 溶液的制備

2.2.1.1 供試品溶液 精密量取濕疹方樣品 5 mL，置于分液漏斗中，加入濃氨試液1 mL，充分振搖后，用30 mL氯仿分3次萃取，每次10 mL，收集氯仿層，置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣用0.1%磷酸水溶液溶解定容至25 mL，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.2 陰性對照 按參柏濕疹搽劑處方工藝制備缺苦參的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成缺苦參的陰性對照溶液。

2.2.1.3 混合對照品溶液 精密稱取苦參堿對照品和氧化苦參堿適量，用0.1%磷酸水超聲溶解，定容，得到70.4 μg·mL-1苦參堿，19.2 μg·mL-1氧化苦參堿混合對照溶液[7-9]。

2.2.2 色譜條件 Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相為乙腈-甲醇-0.1%磷酸=3∶4∶93，流速1.0 mL/min，柱溫30°C，波長220 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.2.3 專屬性試驗 分別取混合對照品溶液，供試品溶液和陰性對照溶液20 μL按照上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖(如圖3所示)。結(jié)果表明，供試品溶液中苦參堿和氧化苦參堿色譜峰于相鄰色譜峰有效分離，分離度均大于1.5，陰性對照表明無其他雜質(zhì)干擾。

圖3 苦參堿和氧化苦參堿高效液相色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系 精密稱取苦參堿對照品 4.4 mg，氧化苦參堿對照品1.2 mg，加適量0.1%磷酸溶液超聲溶解，定容至25 mL。分別取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL, 用0.1%磷酸溶液定容至5 mL，得到苦參堿17.6、35.2、70.4、105.6、140.8、176 μg·mL-1和氧化苦參堿4.8、9.6、19.2、28.8、38.4、48 μg·mL-1的混合對照溶液。以0.45 μm的微孔濾膜過濾后按2.2.2色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以峰面積為Y軸，對照品濃度為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到苦參堿回歸方程為Y=11608X+38703(R2=0.9995),氧化苦參堿回歸方程為Y=12758X+22513(R2=0.9999)，結(jié)果表明，苦參堿在17.6～176 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，氧化苦參堿在4.8～48 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度 精密吸取制備好的同一供試品溶液20 μL，按“2.2.2”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，苦參堿、氧化苦參堿峰面積的RSD分別為0.943%、0.465%(n=6)，表明該色譜條件下方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性 精密吸取制備好的同一供試品溶液20 μL，按“2.2.2”項下色譜條件，分別在制備樣品后 0、2、4、6、8、10、24 h 進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，苦參堿、氧化苦參堿峰面積的RSD分別為1.23%、1.52%(n=6)，均<3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性 取同一批次參柏濕疹搽劑，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，苦參堿、氧化苦參堿的平均含量分別為226.19、33.78 μg·mL-1，RSD 分別為 1.41%、1.75%(n=6)，均<3%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收率 取已知含量的參柏濕疹搽劑1.25 mL，混合對照1.25 mL(其中苦參堿：樣品含量=1∶1，氧化苦參堿：樣品含量=1∶1)，再按“2.2.1(1)”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按“2.2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結(jié)果顯示，苦參堿和氧化苦參堿的平均加樣回收率分別為 104.49%、96.30%，RSD 分別為2.76%、2.05%(n=6)，表明該方法準(zhǔn)確度較好。結(jié)果見表1。

表1 苦參堿和氧化苦參堿加樣回收測定結(jié)果 (n=6)

2.2.9 樣品含量測定 取3個批次(批號20200423，20200522，20200624)參柏濕疹搽劑樣品各3瓶(每瓶500 mL)，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品中苦參堿和氧化苦參堿的含量求平均值。結(jié)果顯示，3個批次樣品中苦參堿、氧化苦參堿的平均含量分別為208.44 μg·mL-1、41.04 μg·mL-1，平均總含量為249.48 μg·mL-1。按平均含量的80%設(shè)限，初步擬定每瓶制劑中苦參堿、氧化苦參堿總含量不得少于199.6 μg·mL-1。樣品中苦參堿、氧化苦參堿含量測定結(jié)果見表2。

表2 三批樣品中苦參堿和氧化苦參堿含量測定結(jié)果 (n=3)

2.3 黃柏堿和小檗堿含量測定

2.3.1 溶液的制備

2.3.1.1 供試品溶液 取樣品2.5 mL，加1%鹽酸甲醇定容至5 mL，離心，取上清液微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.1.2 陰性對照 按參柏濕疹搽劑處方工藝制備缺黃柏的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成缺黃柏的陰性對照溶液。

2.3.1.3 混合對照品溶液 精密稱取黃柏堿對照品和小檗堿適量，用50%(1%鹽酸)甲醇水溶解，定容，得到15 μg·mL-1黃柏堿，65 μg.mL-1小檗堿混合對照溶液[10-13]。

2.3.2 色譜條件 Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸(每100 mL含十二烷基磺酸鈉0.1 g)(B)，梯度洗脫(見表3)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30°C，波長284 nm，進(jìn)樣量20 μL。

表3 梯度洗脫程序

2.3.3 專屬性試驗 分別取混合對照品溶液，供試品溶液和陰性對照溶液20 μL按照上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖(如圖4所示)。結(jié)果表明，供試品溶液中黃柏堿和小檗堿色譜峰與相鄰色譜峰有效分離，分離度均大于1.5，陰性對照表明無其他雜質(zhì)干擾。

圖4 黃柏堿和小檗堿高效液相色譜圖

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密稱取黃柏堿對照品2.4 mg，50%(1%鹽酸)甲醇水定容至10 mL，得0.24 mg·mL-1黃柏堿溶液。精密量取2.5 mL黃柏堿溶液置于10 mL容量瓶中，再加入精密稱定的小檗堿對照品2.6 mg，用50%(1%鹽酸)甲醇水定容至刻度，搖勻。分別取0.4、0.8、1.25、2.1、2.5 mL，用50%(1%鹽酸)甲醇水溶液定容至5 mL，得到黃柏堿4.8、9.6、15、20.4、25.2、30 μg.mL-1和小檗堿20.8、41.6、65、109.2、130 μg·mL-1的混合對照溶液。以0.45 μm的微孔濾膜過濾后按2.3.2色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以峰面積為Y軸，對照品濃度為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到黃柏堿回歸方程為Y=28545X+12888(R2=0.9999)，小檗堿回歸方程為Y=51.187X+98.34(R2=0.9995)，結(jié)果表明，黃柏堿在4.8～30 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，小檗堿在20.8～130 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度 精密吸取制備好的同一供試品溶液20 μL，按“2.3.2”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，黃柏堿、小檗堿峰面積的RSD分別為0.874%、1.643%(n=6)，表明該色譜條件下方法精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性 精密吸取制備好的同一供試品溶液20 μL，按“2.3.2”項下色譜條件，分別在制備樣品后 0、2、4、6、8、10、24 h 進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，黃柏堿、小檗堿峰面積的RSD分別為1.15%、1.90%(n=6)，均<3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性 取同一批次參柏濕疹搽劑，按2.3.1項下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.3.2項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，黃柏堿、小檗堿的平均含量分別為24.5、84.5 μg·mL-1，RSD 分別為 1.46%、2.16%(n=6)，均<3%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.8 加樣回收率 取已知含量的參柏濕疹搽劑1.25 mL，混合對照1.25 mL(其中黃柏堿：樣品含量=1∶1，小檗堿：樣品含量=1∶1)，再按“2.2.2.1(1)”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按“2.3.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結(jié)果顯示，黃柏堿和小檗堿的平均加樣回收率分別為 96.03%、99.87%，RSD 分別為2.35%、1.79%(n=6)，表明該方法準(zhǔn)確度較好。結(jié)果見表4。

表4 黃柏堿和小檗堿加樣回收測定結(jié)果 (n=6)

2.3.9 樣品含量測定 取3個批次(批號20200423，20200522，20200624)參柏濕疹搽劑樣品各3瓶(每瓶500 mL)，按照2.3.1項下方法制備供試品溶液，按2.3.2項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品中黃柏堿和小檗堿的含量求平均值。結(jié)果顯示，3個批次樣品中黃柏堿、小檗堿的平均含量分別為25.39 μg·mL-1、 84.99 μg·mL-1。按平均含量的80%設(shè)限，初步擬定每瓶制劑中黃柏堿含量不得少于20.3 μg·mL-1、小檗堿含量不得少于68.0 μg·mL-1。樣品中黃柏堿、小檗堿含量測定結(jié)果見表5。

表5 三批樣品中黃柏堿和小檗堿含量測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

苦參和黃柏是參柏濕疹搽劑方中的君藥，所以選擇對苦參和黃柏進(jìn)行定性鑒別和定量檢測，以苦參中主要有效成分苦參堿、氧化苦參堿，黃柏中的主要有效成分小檗堿和黃柏堿為檢測指標(biāo)建立了高效液相色譜含量測定方法?？紤]中藥復(fù)方制劑中苦參堿和氧化苦參堿可能在一定條件下相互轉(zhuǎn)化[14]，選擇苦參堿和氧化苦參堿的總量為檢測指標(biāo)。

在進(jìn)行黃柏的薄層鑒別時，樣品中的黃柏堿斑點看不到，加大點樣量以后看到了，可知是樣品中黃柏堿含量較低的緣故。調(diào)整樣品處理量為50 mL后，可以看到黃柏堿斑點。

進(jìn)行小檗堿含量測定研究時，發(fā)現(xiàn)測得的含量不穩(wěn)定，考慮其溶解性的緣故，經(jīng)過嘗試甲醇，1%鹽酸甲醇，50%甲醇水后，調(diào)整樣品和對照品的配制溶劑為50%(1%鹽酸甲醇)水。經(jīng)過調(diào)整后，峰型較好，含量比較穩(wěn)定。

綜上，研究建立了參柏濕疹搽劑中苦參、黃柏的薄層色譜鑒別方法，鑒別斑點清晰，陰性對照無干擾；建立了搽劑中苦參堿、氧化苦參堿和黃柏堿、小檗堿的高效液相色譜含量測定方法，并初步擬定了苦參堿和氧化苦參堿總含量不少于199.6 μg·mL-1，黃柏堿、小檗堿含量分別不少于20.3 μg·mL-1和68.0 μg·mL-1的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。