張秋陽，蔣小玲，程云帆，潘曉東

富亮氨酸重復(fù)序列激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)基因位于染色體12p11.2-q13.1，其所編碼的LRRK2蛋白，屬于ROCO超家族，是由2 527個氨基酸組成的大分子蛋白。最新發(fā)現(xiàn)LRRK2可以作為神經(jīng)囊泡運輸、免疫及炎癥的主要調(diào)節(jié)劑，其突變在引起帕金森病(Parkinson's disease，PD)、路易體癡呆、麻風(fēng)病、克羅恩病等中樞和外周免疫相關(guān)疾病中具有重要作用[1]。迄今為止，在PD研究領(lǐng)域，LRRK2基因仍是研究的熱點。除PD外，近年來的遺傳學(xué)研究表明，LRRK2突變與阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的病理改變及發(fā)生風(fēng)險密切相關(guān)，本文將對此展開綜述。

1 LRRK2的結(jié)構(gòu)及介導(dǎo)的信號通路

LRRK2基因也稱為Park8 基因，是一種大小為280 KDa的多區(qū)域多功能、廣泛表達的大分子蛋白[1]。其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)域和廣泛的表達，預(yù)示著其復(fù)雜的細(xì)胞功能和活動。LRRK2通過ROC-COR結(jié)構(gòu)域賦予GTPase活性和絲氨酸-蘇氨酸激酶兩種不同酶活性的結(jié)構(gòu)域，嵌入ARM、ANK、LRR及WD40 4個蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域中[1]。在LRRK2的兩種酶活性中，大部分功能都集中在激酶活性上。最常見的致病變異體G2019S突變會導(dǎo)致其激酶活性升高[2]。由此猜想，所有致病突變可能通過底物蛋白的過度磷酸化而導(dǎo)致疾病的病理狀態(tài)。此機制促進了開發(fā)LRRK2激酶抑制劑的可能性。

LRRK2介導(dǎo)的信號通路包括生長因子、存活、死亡受體和Wnt信號通路[3-4]。到目前為止，LRRK2的上游調(diào)控是通過結(jié)構(gòu)性活性激酶GSK3β和CK1α的異磷酸化進行的。這些激酶以及PKA會磷酸化ANK和LRR重復(fù)序列之間的殘基，而磷酸酶PP1會介導(dǎo)磷酸化位點的去磷酸化，從而影響與14-3-3蛋白的相互作用。反過來，這種異磷酸化是與14-3-3蛋白相互作用所必需的，對LRRK2的亞細(xì)胞定位具有重要意義[5]。有研究發(fā)現(xiàn)Rab蛋白是最成熟的LRRK2激酶底物。Rab29已被確定為LRRK2的上游GTPase，它將GTP結(jié)合的LRRK2招募到反式高爾基體中，從而增強LRRK2 S1292的自動磷酸化，并可能增加LRRK2的異磷酸化，同時刺激高爾基體衍生的囊泡清除[6]。這表明LRRK2在Rab蛋白的下游和上游，特別是Rab29的下游和Rab8a、Rab10及Rab29的上游分別存在一個信號環(huán)。根據(jù)LRRK2作為信號支架的角色，這種在反式高爾基體的復(fù)雜相互作用很可能發(fā)生在多蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物中。

2 LRRK2的定位與表達

LRRK2主要存在于細(xì)胞質(zhì)中[7]。LRRK2富含于脂筏、早期內(nèi)小體、溶酶體、突觸小泡及質(zhì)膜，也存在于高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體外膜[8]。此外，LRRK2也與內(nèi)化的表皮生長因子存在共定位，表明相當(dāng)一部分蛋白質(zhì)存在于內(nèi)體系統(tǒng)膜上。LRRK2在幾種膜結(jié)構(gòu)中的豐富表達，提示了LRRK2在膜轉(zhuǎn)運中的作用。同時LRRK2還與網(wǎng)格蛋白輕鏈(CLC)存在部分共定位，這可能反映了LRRK2在蛋白質(zhì)降解過程中參與多泡小體形成的早期內(nèi)體(EEA1)的雙層網(wǎng)格蛋白涂層[9]。因此，CLC可能作為一種支架將LRRK2募集到早期內(nèi)體的雙層網(wǎng)格蛋白涂層上。有研究提示，在高表達LRRK2的不同細(xì)胞類型中經(jīng)氯喹處理后，LRRK2被募集到擴大的溶酶體上并激活，其上游接頭Rab29促進LRRK2在溶酶體上的募集[10]。LRRK2與幾種細(xì)胞骨架、轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白及RabGTPase家族的相互作用進一步支持了LRRK2在蛋白降解途徑中的作用[11-12]。

LRRK2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也有表達。小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦的常駐免疫細(xì)胞，關(guān)于LRRK2是否在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達目前報道并不一致。通過人類和小鼠純化的腦細(xì)胞分類群體的轉(zhuǎn)錄分析表明，在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中可以檢測到LRRK2轉(zhuǎn)錄本，而在小膠質(zhì)細(xì)胞中的檢測率明顯減少[13]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，在人類的小膠質(zhì)細(xì)胞、成年小鼠以及來自幼鼠的原代小膠質(zhì)細(xì)胞檢測到大量的LRRK2 mRNA和蛋白表達[14-16]。造成上述結(jié)果差異的機制尚不明確，很可能是由于在固定的腦組織中使用LRRK2抗體的特異性和重復(fù)性問題，另一種可能是難以準(zhǔn)確分離小膠質(zhì)細(xì)胞從而導(dǎo)致研究結(jié)論產(chǎn)生差異。

3 LRRK2的生理功能

LRRK2涉及細(xì)胞系統(tǒng)的多個功能，如細(xì)胞遷移、自噬、吞噬作用及炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生調(diào)控[17-18]。在小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞中，R1441G突變導(dǎo)致脂多糖(LPS)驅(qū)動的炎性細(xì)胞因子釋放增加[15]，而敲除LRRK2基因的表達具有相反的作用[19]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，LRRK2G2019S突變的中老年小鼠的皮層、紋狀體腦區(qū)中的炎性細(xì)胞因子及其補體的表達水平較高[20]，表明LRRK2基因突變在中樞免疫細(xì)胞具有病理作用。

LRRK2也與細(xì)胞自噬有關(guān)。自噬的降解途徑在調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的不同方面起著至關(guān)重要的作用，并且由于這兩條途徑在溶酶體上的匯聚而與吞噬作用有內(nèi)在的聯(lián)系。有研究表明，LPS刺激單核細(xì)胞系增加了LRRK2向自噬體膜的募集，LRRK2基因的敲除導(dǎo)致自噬缺陷[21]。此外，在小鼠巨噬細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶酶體超負(fù)荷應(yīng)激時，LRRK2與RAB7L1一起被招募到溶酶體，在溶酶體中，LRRK2通過磷酸化使Rab8和Rab10特異性地穩(wěn)定在過載的溶酶體上[10]。同一研究發(fā)現(xiàn)，LRRK2基因敲除增加了空泡化和脂褐素的自發(fā)熒光，表明LRRK2可能在溶酶體應(yīng)激時，防止溶酶體擴大和上調(diào)溶酶體的分泌。

4 LRRK2突變與PD

LRRK2基因的顯性遺傳突變可能是家族性和散發(fā)性PD最常見的原因，已在大約3%～5%的家族性和1%～3%的散發(fā)性PD病例中發(fā)現(xiàn)，不同人群的發(fā)病率可能有很大差異。目前的研究發(fā)現(xiàn)G2019S和R1441C是最常見的兩種突變，在某些人群中占遺傳性PD病例的30%，在散發(fā)型PD病例中分別占10%和2.5%[22]。LRRK2的病理功能主要與異常的激酶活性有關(guān)。一般來說，LRRK2致病突變體的高激酶活性與PD的一系列神經(jīng)病理特征相關(guān)，包括α突觸核蛋白異常沉積、磷酸化Tau蛋白的積累、TDP-43的聚集、多巴胺能神經(jīng)元死亡、多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和活性受損、炎癥反應(yīng)及氧化損傷等[23]。最近有研究對臺灣人群的LRRK2基因測序發(fā)現(xiàn)，LRRK2G2385R變異在PD患者中的發(fā)生率是正常人的兩倍，證實LRRK2G2385R突變是亞洲人群的風(fēng)險因素[24]。該突變位于WD40的C末端區(qū)域，可能改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并調(diào)節(jié)LRRK2與囊泡運輸相關(guān)的相互作用因子的結(jié)合。有趣的是，LRRK2R1398H已被確定可通過降低蛋白活性來預(yù)防PD[25]。罕見的LRRK2編碼變異與較早的疾病發(fā)病年齡有關(guān)[26]。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明，LRRK2基因的編碼和非編碼變異與PD發(fā)生有很強的聯(lián)系，其可影響發(fā)病年齡及外顯率，并導(dǎo)致PD發(fā)病的易感性和保護性。

5 LRRK2突變與AD

盡管LRRK2突變并不常見于AD，但研究顯示LRRK2突變與AD病理改變明顯關(guān)聯(lián)[27]。Tau蛋白過度磷酸化是AD患者的普遍病理特征。磷酸化形式的Tau從微管蛋白解離并自聚集形成神經(jīng)內(nèi)纏結(jié)，這與神經(jīng)元毒性和AD病理有關(guān)[23]。先前的研究表明，致病突變體LRRK2G2019S和I2020T可直接在Thr181位點磷酸化Tau蛋白，引起Tau蛋白過度磷酸化[28]。引起Tau 蛋白過度磷酸化的有 GSK3β、MAPKs及CDK5 蛋白激酶，抑制 Tau 磷酸化的有 PP2A及PP2B等去磷酸化酶。LRRK2可以通過磷酸化激活GSK3β，調(diào)節(jié)p38MAPK使 Tau 過度磷酸化[29-30]。另一方面，淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)在AD發(fā)病機制中具有重要作用。有研究表明，AD患者的大腦中存在APP的磷酸化，其與淀粉樣蛋白沉積的產(chǎn)生相關(guān)。有證據(jù)表明APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(APP intracellular domain，AICD)在APP相關(guān)疾病(如AD)中可能產(chǎn)生作用。APP Thr668位點的磷酸化可促進AICD的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)錄活性。LRRK2與APP在其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的Thr668位點相互作用并磷酸化。有研究發(fā)現(xiàn)，LRRK2G2019S突變致患者死后腦組織和多巴胺能神經(jīng)元中Thr668處磷酸化APP的數(shù)量明顯高于健康人。而LRRK2抑制劑可降低患者來源的多巴胺能神經(jīng)元和LRRK2G2019S小鼠中腦Thr668位點APP的磷酸化。由此可見，APP是LRRK2的底物，LRRK2可能通過影響APP磷酸化和AICD功能參與AD的發(fā)病機制[31]。

此外，LRRK2某些基因位點突變也與AD發(fā)生風(fēng)險關(guān)聯(lián)。亞洲人群最常見的LRRK2R1628P突變可減輕AD發(fā)生風(fēng)險[32]，R1628P突變可導(dǎo)致LRRK2激酶功能減低，提示LRRK2缺失可能在AD中具有保護作用。最近，有研究對75個中國AD家庭非攜帶性癡呆基因致病突變的先證者進行了277個神經(jīng)退行性相關(guān)基因的靶向測序，發(fā)現(xiàn)LRRK2I2012T突變在早發(fā)性阿爾茨海默病(early onset Alzheimer’s disease，EOAD)家庭中被發(fā)現(xiàn)[33]。這些發(fā)現(xiàn)提供了LRRK2基因變異可能與AD易感性有關(guān)的證據(jù)。

6 LRRK2的臨床意義

LRRK2是一種大而復(fù)雜的蛋白，在疾病的病理生理過程中起著重要作用，其GTPase和激酶結(jié)構(gòu)域的突變與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。LRRK2突變及功能異常促進α突觸核蛋白異常沉積、Tau病理、炎性反應(yīng)、突觸功能障礙及自噬溶酶體機能異常[20，34-35]，這些病理生理改變在AD、PD及路易體癡呆(dementia with Lewy bodies,DLB)等神經(jīng)變性疾病中共同存在。這些發(fā)現(xiàn)強烈提示LRRK2可能成為干預(yù)AD、PD等神經(jīng)變性疾病的潛在有價值的藥理靶點。

LRRK2 某些位點突變(如G2019S、R1441C)可引起LRRK2酶活性異常增高和功能異常[2,36]，從而引起神經(jīng)毒性。針對LRRK2酶活性的治療可能成為神經(jīng)變性疾病的一種治療手段。部分研究者致力于開發(fā)臨床適用的小分子LRRK2激酶抑制劑。目前，LRRK2激酶抑制劑的開發(fā)取得了顯著進展。最近DNL201LRRK2激酶抑制劑進入了健康志愿者的Ⅰa期臨床試驗。盡管尚不清楚其潛在的長期副作用，但現(xiàn)有的結(jié)果顯示志愿者可以耐受急性LRRK2抑制作用，因此有希望在未來進入臨床使用[37]。

盡管LRRK2激酶抑制劑的開發(fā)和使用在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域取得了令人鼓舞的進展，但其確切的LRRK2生物學(xué)功能及藥理抑制作用目前尚不清楚。越來越多的證據(jù)表明，遺傳基因效應(yīng)和外周免疫之間的相互作用改變了神經(jīng)變性疾病發(fā)病風(fēng)險。LRRK2激酶抑制劑的抗炎特性可能通過下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞或外周免疫來改變疾病病理進展，在早期延緩LRRK2突變風(fēng)險攜帶者高炎癥水平的發(fā)病時間[38]。

最后，值得注意的是，針對LRRK2的治療方法除了小分子激酶抑制劑之外，有研究報道LRRK2反義寡核苷酸(LRRK2ASO)可以降低臨床前疾病模型大腦中LRRK2的表達水平[39]。LRRK2ASO治療的安全性和耐受性的Ⅰ期試驗(BIIB094)也已證明了其療效和安全性。鞘內(nèi)注射ASO，可以避免干擾外周的LRRK2表達。設(shè)計獨特的LRRK2特定突變體和(或)針對不同組織(細(xì)胞群)的靶向療法可能是有益的。但仍然需要進一步了解LRRK2在免疫系統(tǒng)中的作用及LRRK2相關(guān)激酶調(diào)節(jié)炎癥性疾病的機制，才能有效地在神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中優(yōu)化使用靶向LRRK2制劑，改善神經(jīng)變性疾病的癥狀及病理損害，從而延緩疾病進程。