金良怡 尹智華

【摘要】 目的：探討miR-9介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）通路對(duì)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響。方法：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的JEG-3細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、miR-NC組與miR-9組，miR-NC組與miR-9組轉(zhuǎn)染終濃度為100 nmol/L的miR-NC與miR-9 mimics，對(duì)照組轉(zhuǎn)染等體積的磷酸鹽緩沖液。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，Annexin V/FITC檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HIF-1α蛋白表達(dá)。結(jié)果：轉(zhuǎn)染后24、36 h，miR-9組細(xì)胞侵襲指數(shù)與細(xì)胞增殖指數(shù)均明顯較對(duì)照組與miR-NC組低（P<0.05），細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于對(duì)照組與miR-NC組（P<0.05）。轉(zhuǎn)染后24、36 h，miR-9組的SOD含量均高于對(duì)照組與miR-NC組（P<0.05），MDA含量、HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于對(duì)照組與miR-NC組（P<0.05）。結(jié)論：miR-9在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的高表達(dá)能抑制HIF-1α的表達(dá)，維持氧化應(yīng)激處于平衡狀態(tài)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖與侵襲。

【關(guān)鍵詞】 miR-9 妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 氧化應(yīng)激 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞增殖

Effects of miR-9-mediated HIF-1α Pathway on Oxidative Stress Damage of Gestational Trophoblasts/JIN Liangyi， YIN Zhihua. //Medical Innovation of China， 2022， 19（02）： 0-027

[Abstract] Objective： To investigate the effects of miR-9-mediated Hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α） pathway on the oxidative stress damage of gestational trophoblasts. Method： JEG-3 cells in logarithmic growth phase were randomly divided into three groups-control group， miR-NC group and miR-9 group， miR-NC group and miR-9 group were transfected with miR-NC and miR-9 mimics at final concentration of 100 nmol/L， the control group were transfected with equal volume of phosphate buffer. MTT method were used to detect cell proliferation， Annexin V/FITC were to detect cell apoptosis， Transwell chamber were to detect cell invasion， enzyme-linked immunoassay were to detect oxidative stress damage indicators， Western blotting were to detect HIF-1α protein expression. Result： At 24 h and 36 h after transfection， the cell proliferation index and cell invasion index of the miR-9 group were lower than those of the the control group and miR-NC group （P<0.05）， and the apoptosis index were higher than those of the the control group and miR-NC group （P<0.05）. At 24 h and 36 h after transfection， the SOD content of miR-9 group were higher than those of the control group and miR-NC group （P<0.05）， MDA content and relative expression levels of HIF-1α protein were lower than those of the control group and miR-NC group （P<0.05）. Conclusion： The high expression of miR-9 in gestational trophoblasts can inhibit the expression of HIF-1α， maintain oxidative stress in balanced state， promote cell apoptosis， inhibit cell proliferation and invasion.

[Key words] miR-9 Gestational trophoblast Hypoxia-inducible factor-1α Oxidative stress Apoptosis Cell proliferation

First-author’s address： Shenyang Women’s and Children’s Hospital， Shenyang 110011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.02.006

胎盤是聯(lián)系胎兒和母體的紐帶，有免疫屏障、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)分泌等多種功能。滋養(yǎng)細(xì)胞可參與人類胎盤的形成，能分泌一些血管舒縮物質(zhì)、胎盤激素、酶和體液因子，通過旁分泌、自分泌等途徑調(diào)節(jié)著胎盤的血液循環(huán)[1]。妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷可參與對(duì)母體免疫損害或病原體入侵的監(jiān)視活動(dòng)，對(duì)胎兒-胎盤血管張力產(chǎn)生不良影響，也可影響該部位的血管滲透壓[2-3]。miRNA是內(nèi)源性非編碼小分子RNA，能通過靶向調(diào)控mRNA的表達(dá)，從而參與調(diào)控機(jī)體細(xì)胞的生物學(xué)功能，對(duì)于滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、凋亡、生長(zhǎng)等方面均有重要的調(diào)控作用[4]。miR-9被認(rèn)為是一種能夠促進(jìn)多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要的原癌microRNA，能抑制心肌氧化損傷，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，也能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與腫瘤血管生成[5-6]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)與生長(zhǎng)[7]。HIF-1α可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞PI3K/AKT/FRAP途徑，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡[8-9]。本文具體探討了miR-9介導(dǎo)HIF-1α通路對(duì)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響，希望能夠揭示miR-9介導(dǎo)在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的分子作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究在2018年1月-2020年12月進(jìn)行。JEG-3絨毛膜癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所，低糖DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司，Western blot檢測(cè)一抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，miR-9 mimics（模擬物）、miR-NC購(gòu)自德國(guó)吉瑪公司、TRIzol提取試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技公司、PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海雅吉生物公司，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的JEG-3細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、miR-NC組與miR-9組，miR-NC組與miR-9組轉(zhuǎn)染終濃度為100 nmol/L的miR-NC與miR-9 mimics，對(duì)照組轉(zhuǎn)染等體積的磷酸鹽緩沖液，轉(zhuǎn)染后6 h進(jìn)行換液培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24、36 h棄去上清，加入終濃度0.5 g/L MTT 100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將上清液棄除，加入150 μL DMSO后震蕩，時(shí)間為10 min，在490 nm下測(cè)定吸光度，從而計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。

1.4 Annexin V/FITC檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用400 μL Annexin V/FITC結(jié)合液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109個(gè)/L。加入5 μL Annexin V/FITC染色液與10 μL PI染色液，避光孵育15 min，采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.5 細(xì)胞侵襲 取基質(zhì)膠100 μL，將其均勻覆蓋于Transwell的小室底部，調(diào)整細(xì)胞濃度后加入至Transwell上室中，并在下室中加入培養(yǎng)基，之后行固定、染色，在顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞侵襲指數(shù)。

1.6 氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)測(cè)定 收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸于0.5 mL緩沖液中，超聲破碎細(xì)胞，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)上清SOD和MDA水平。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HIF-1α蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（HIF-1α，1︰1 000;β-actin，1︰2 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1︰2 000）室溫孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)試劑，曝光顯影后采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。上述實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS 23.00軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)用（x±s）表示，兩兩對(duì)比為L(zhǎng)SD-t檢驗(yàn)，多組間使用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖指數(shù)對(duì)

比 轉(zhuǎn)染后24、36 h，三組細(xì)胞增殖指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;轉(zhuǎn)染后24、36 h，miR-9組的細(xì)胞增殖指數(shù)均較對(duì)照組、miR-NC組低（P<0.05）。見表1。

2.2 三組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡指數(shù)對(duì)

比 轉(zhuǎn)染后24、36 h，三組細(xì)胞凋亡指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;轉(zhuǎn)染后24、36 h，miR-9組的細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于對(duì)照組與miR-NC組（P<0.05）。見表2。

2.3 三組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞侵襲指數(shù)對(duì)

比 轉(zhuǎn)染后24、36 h，三組細(xì)胞侵襲指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;轉(zhuǎn)染后24、36 h，miR-9組的細(xì)胞侵襲指數(shù)均明顯較對(duì)照組與miR-NC組低（P<0.05）。見表3。

2.4 三組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的SOD和MDA含量對(duì)比 轉(zhuǎn)染后24、36 h，三組SOD和MDA比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;轉(zhuǎn)染后24、36 h，miR-9組的SOD含量均明顯較對(duì)照組與miR-NC組高（P<0.05），MDA含量均低于對(duì)照組與miR-NC組（P<0.05）。見表4。

2.5 三組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比 轉(zhuǎn)染后24、36 h，三組HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;轉(zhuǎn)染后24、36 h，miR-9組的HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)水平均明顯較對(duì)照組與miR-NC組低（P<0.05）。見圖1與表5。

3 討論

胎兒-胎盤循環(huán)具有血流量大、缺少自主神經(jīng)支配、低血流阻力等特點(diǎn)，主要靠血管活性物質(zhì)來(lái)維持其循環(huán)狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體缺乏葡萄糖、脂質(zhì)過度負(fù)荷、病毒感染、分泌蛋白合成增加等均可影響機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，有可能導(dǎo)致應(yīng)激損傷，從而誘發(fā)細(xì)胞功能受損疾病的發(fā)生[10-11]。miR-9在不同的組織部位具有不同的表達(dá)譜，在免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)、病毒感染等多種疾病中有重要作用。有研究認(rèn)為miR-9能通過作用于不同靶向基因參與惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程，miR-9可通過靶向下調(diào)促癌基因的編導(dǎo)，從而促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲[12-13]。本研究顯示轉(zhuǎn)染后24、36 h，miR-9組的細(xì)胞增殖、侵襲指數(shù)均低于對(duì)照組與miR-NC組（P<0.05），表明miR-9在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的高表達(dá)能抑制細(xì)胞增殖與侵襲。

microRNA是由23個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA分子，可參與機(jī)體的多個(gè)生命過程中。胎盤作為母嬰物質(zhì)交換界面的同時(shí)也是內(nèi)分泌器官，可通過妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生重要作用。miRNA與妊娠滋養(yǎng)行疾病的發(fā)生及發(fā)展顯著相關(guān)[14-15]。本研究顯示轉(zhuǎn)染后24、36 h，miR-9組的細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于對(duì)照組與miR-NC組（P<0.05），表明miR-9在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的高表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激在妊娠糖尿病與妊娠高血壓發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，和正常妊娠相比，妊娠糖尿病與妊娠高血壓孕婦的胎盤中抗氧化酶減少與脂質(zhì)過氧化物增加[16]。正常情況下，機(jī)體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，內(nèi)外在各種因素的刺激可導(dǎo)致活性氧大量生成，可超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力，造成機(jī)出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而導(dǎo)致病理?yè)p傷[17]。本研究顯示轉(zhuǎn)染后24、36 h，miR-9組的SOD含量均高于對(duì)照組與miR-NC組（P<0.05），MDA含量均低于對(duì)照組與miR-NC組（P<0.05），表明miR-9在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的高表達(dá)能改善氧化應(yīng)激狀態(tài)。SOD是體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的主要防線，SOD水平下降可誘發(fā)MDA的產(chǎn)生，而后者對(duì)細(xì)胞有毒性作用，可間接反映氧自由基的存在及對(duì)細(xì)胞的損傷程度，從而影響細(xì)胞增殖與凋亡[18-19]。

HIF-1α是HIF-1特有的活性亞單位，對(duì)HIF-1的活性發(fā)揮決定性作用。腫瘤細(xì)胞中的HIF-1α活性增加，表明腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲水平增加[20]。miR-9可通過靶向調(diào)控HIF-1α發(fā)揮對(duì)細(xì)胞各項(xiàng)生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)作用[21]。本研究顯示轉(zhuǎn)染后24、36 h，miR-9組的HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于對(duì)照組與miR-NC組（P<0.05），表明miR-9在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的高表達(dá)能抑制HIF-1α的表達(dá)。不過本研究并未明確HIF-1α是否為miR-9的下游靶基因，后續(xù)還需要進(jìn)行深入分析。

綜上所述，miR-9在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的高表達(dá)能抑制HIF-1α的表達(dá)，維持氧化應(yīng)激處于平衡狀態(tài)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖與侵襲。

參考文獻(xiàn)

[1]張靜，王光允，張秀梅，等.妊娠高血壓疾病與血管細(xì)胞粘附因子相關(guān)性的研究[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，14（15）：1267-1269.

[2]吳琪瑞，王艷華，柴麗芬，等.circRNA RBM39與miR-5088-5p在缺氧誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞自噬中的作用[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2020，36（5）：570-574.

[3] DE SOUZA M G，DE JESUS S F，SANTOS E M，et al.Radiation Therapy Reduced Blood Levels of LDH， HIF-1α， and miR-210 in OSCC[J].Mol Genet Genomic Med，2020，26（1）：433-442.

[4] LIU Z Z，TIAN Y F，WU H，et al.LncRNA H19 promotes glioma angiogenesis through miR-138/HIF-1α/VEGF axis[J].Neoplasma，2020，67（1）：111-118.

[5] YU M，OZAKI T，SUN D，et al.HIF-1α-dependent miR-424 induction confers cisplatin resistance on bladder cancer cells through down-regulation of pro-apoptotic UNC5B and SIRT4[J].

J Exp Clin Cancer Res，2020，39（1）：108.

[6] ZHANG H，LIU X，YANG F，et al.Overexpression of HIF-1α protects PC12 cells against OGD/R-evoked injury by reducing miR-134 expression[J].Cell Cycle，2020，19（9）：990-999.

[7] WANG H，ZHAO Y，LUO R，et al.A positive feedback self-regulatory loop between miR-210 and HIF-1α mediated by CPEB2 is involved in trophoblast syncytialization： implication of trophoblast malfunction in preeclampsia[J].Cell Cycle，2020，102（3）：560-570.

[8] WANG X，LI L，ZHAO K，et al.A novel LncRNA HITT forms a regulatory loop with HIF-1α to modulate angiogenesis and tumor growth[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2020，27（4）：1431-1446.

[9]高艷，楊洋，延佳佳，等.miR-18a對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞中再生蛋白1

表達(dá)的影響[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，50（6）：758-761.

[10]潘平山，覃嘉怡.胎盤循環(huán)與胎兒生長(zhǎng)受限的研究進(jìn)展[J/OL].實(shí)用婦科內(nèi)分泌雜志（電子版），2018，5（20）：13-14.

[11]楊娟，謝瑩?dān)L.miR-182調(diào)控HIF-2α通路對(duì)低氧誘導(dǎo)子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，55（6）：876-881.

[12]張麗華.miR-181a和GATA6在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中的表達(dá)及臨床意義[J].河北醫(yī)藥，2020，42（9）：1315-1319.

[13]陳芳榮，龔護(hù)民，鄭林媚.長(zhǎng)鏈非編碼RNA MALAT1與微小核糖核酸-146a相互作用對(duì)子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2020，26（12）：915-920.

[14]李想.受孕激素調(diào)控的miR-31在乳腺發(fā)育中的功能與分子機(jī)制[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[15]張婧怡，馮玲，賈靜，等.miRNA-101通過調(diào)控胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞功能參與妊娠期糖尿病的發(fā)病[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2019，28（7）：518-522.

[16]許凡萍，汪啟兵，劉艷玲，等.氧化應(yīng)激與妊娠疾病的相關(guān)性研究[J].生命的化學(xué)，2016，36（6）：929-933.

[17] ZHU L，MU J，WU Y，et al.Role of HIF-1α in Cold Ischemia Injury of Rat Donor Heart Via the miR-21/PDCD4 Pathway[J].Cell Death Differ，2020，52（1）：383-391.

[18]劉慧敏，李筱薇，李會(huì)芳.妊娠期糖尿病發(fā)病與妊娠期氧化應(yīng)激強(qiáng)度的相關(guān)性以及還原性谷胱氨肽的治療效果[J].中國(guó)婦幼保健，2019，34（8）：1734-1737.

[19]張晨晨，韋有恒，豐有吉，等.妊娠期糖尿病患者氧化應(yīng)激水平變化及臨床意義[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2019，19（1）：52-57.

[20] HAN N，XU H，YU N，et al.MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy （OIR） rat model via targeting VEGFA and HIF-1α[J].Pathol Oncol Res，2020，47（1）：85-94.

[21] KARSHOVSKA E，WEI Y，SUBRAMANIAN P，et al.HIF-1α （Hypoxia-Inducible Factor-1α） Promotes Macrophage Necroptosis by Regulating miR-210 and miR-383[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2020，40（3）：583-596.

（收稿日期：2021-05-26） （本文編輯：張爽）