牟泓曄，周小杰，楊永春，王曉杜，周瑩珊,2,*，宋厚輝,*

(1.浙江農林大學 動物科技學院·動物醫(yī)學院，浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應用技術研究重點實驗室，動物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測技術浙江省工程研究中心，浙江 杭州 311300；2.浙江農林大學 動物科技學院·動物醫(yī)學院，浙江省動物醫(yī)學與健康管理國際科技合作基地，中澳動物健康大數(shù)據(jù)分析聯(lián)合實驗室，浙江 杭州 311300)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬()的單股環(huán)狀無囊膜DNA病毒。其中豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是主要的致病型病毒，在臨床中常引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，皮炎腎病綜合征，繁殖障礙以及呼吸道、腸道和多系統(tǒng)的炎癥反應。2015年，一種新型的豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)被發(fā)現(xiàn)。這兩種病毒感染在臨床上有相似的繁殖障礙和呼吸道、腸道癥狀，給臨床檢測和防治帶來一定困難。因此，急需建立一種檢測方法對PCV2和PCV3的臨床感染進行快速鑒別區(qū)分，以便及時做好防治和控制病原工作。

目前針對PCV2和PCV3的檢測方法有普通PCR檢測、普通二重PCR檢測、單重熒光定量PCR檢測、蛋白瓊脂擴散檢測、抗體膠體金免疫層析檢測、間接ELISA檢測等檢測方法，這些檢測方法均能對PCV2和PCV3病原進行特異性檢測，但尚存在不足還需進一步完善。因此，本研究基于已有實驗基礎針對PCV2和PCV3特異性序列分別設計2對引物和1對探針，應用man探針法雙重熒光定量PCR技術建立了一種可以同時檢測區(qū)分PCV2和PCV3的定量檢測方法，為PCV2和PCV3混合感染的診斷提供了特異、靈敏、快速的初步檢測依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒及病料

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細小病毒(PPV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、經(jīng)商品化試劑盒檢測為陽性的PCV2和PCV3病料均由本實驗室保存。181份來自浙江省不同規(guī)模養(yǎng)殖場豬胸腔附近的肌肉及全血樣品由本室采集并保存。

1.2 試劑及儀器

ProbeqPCR檢測試劑盒購自大連寶生物公司，病毒核酸提取試劑盒購自武漢市藤源恒峰生物科技有限公司，小提質粒試劑盒和質粒純化試劑盒購自北京天根公司，Trizol試劑購自上海賽默飛世爾科技有限公司。

MX3000P型熒光定量PCR儀購自Agilent(美國)，SynergyH1型酶標儀購自BioTek(美國)，全自動樣品快速研磨儀購自上海凈信公司，低溫高速離心機和小型高速離心機購自Eppendorf(德國)。

1.3 引物和探針的設計與合成

參照GenBank發(fā)表的PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因的保守序列，利用SnapGene軟件設計PCV2和PCV3特異性引物和Man探針。其中，PCV2的2條引物序列分別為5′-TCACCTATGACCCCTATG-3′和5′-GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-3′，擴增片段長度117 bp；PCV3的2條引物序列分別為5′-TGGCTCAACACATATGAC-3′和5′-ACGGACTTGTAACGAATC-3′，擴增片段長度125 bp。針對PCV2和PCV3設計的探針序列分別為FAM-ACTCCTCTCGCCATACCATAACC-BHQ1和HEX-TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCA-BHQ1。設計的引物和探針均由杭州有康生物科技有限公司進行合成

1.4 重組質粒標準品的構建和鑒定

使用病毒核酸提取試劑盒分別提取PCV2、PCV3陽性病料核酸作為模板，PCR擴增相應目的基因。反應條件均為：98 ℃ 3 min；98 ℃ 15 s，52 ℃ 5 s，68 ℃ 5 s，共35個循環(huán)；68 ℃ 5 min。PCR產物純化回收后連接到pMD18-T載體，構建重組質粒，PCR鑒定為陽性后由上海金唯智生物科技有限公司測序鑒定后測定質粒濃度，計算拷貝數(shù)，作為質粒標準品。

1.5 反應條件的優(yōu)化與標準曲線建立

本研究建立在單重熒光定量實驗的基礎上，采用矩陣法調整引物和探針的濃度，以此確定一個優(yōu)化后的反應體系。以PCV2和PCV3質粒為DNA模板，分別稀釋到1×10拷貝·μL，再依次進行10倍稀釋，繪制標準曲線。

1.6 特異性試驗

使用病毒核酸提取試劑盒提取PRRSV、PRV、PPV、CSFV、PEDV、TGEV核酸后，將各病毒DNA和反轉錄得到的cDNA作為模板，利用優(yōu)化后的體系和條件進行擴增，檢測其特異性。

1.7 敏感性試驗

將PCV2和PCV3的陽性質粒進行1∶1混合作為混合質粒，作10倍稀釋，稀釋后的濃度為1.0×10～1.0×10拷貝·μL進行敏感性檢測，以ddHO為陰性對照，同時利用本實驗室建立的常規(guī)PCR進行檢測，比較兩種方法的靈敏度差異。

1.8 重復性試驗

分別以濃度為10、10、10拷貝·μL的1.7節(jié)中標準品混合物作為模板分別進行3次重復擴增，進行組內重復試驗，選取3個不同時間點，對上述標準品模板分別擴增，進行組間重復試驗，計算Ct值的標準差(SD)和變異系數(shù)(CV)檢測其重復性。

1.9 臨床樣品符合率檢測

從浙江省不同規(guī)模養(yǎng)豬場采集到181份臨床豬肉和全血樣品，豬肉樣品通過磁珠研磨裂解提取核酸，全血離心后取上層血清利用Trizol法抽提核酸，分別通過本研究中構建的雙重熒光定量檢測方法和普通熒光PCR檢測方法對其進行PCV2(GB/T35901-2018)和PCV3(T/CVMA X8-2019)檢測后分析其陽性符合率。

2 結果與分析

2.1 PCV2和PCV3重組質粒標準品的構建

PCV2和PCV3重組質粒以陽性病料核酸為模板經(jīng)PCR擴增后，分別在117 bp和125 bp出現(xiàn)目的條帶(圖1)，表明成功擴增出目的基因。根據(jù)公式計算pMD-PCV2和pMD-PCV3的初始拷貝數(shù)分別為1.07×10拷貝·μL和1.2×10拷貝·μL。

2.2 熒光定量PCR反應條件優(yōu)化結果與標準曲線的建立

經(jīng)過實驗優(yōu)化后，建立的雙重熒光定量反應總體系20 μL，其中Premix酶10 μL，上下游引物均為0.4 μL(0.2 μmol·L)，探針均為0.8 μL(0.2 μmol·L)，模板各2 μL，剩余體積用DEPC水補足，反應程序為95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。

M，DL2000 DNA分子質量標記；1，PCV3基因；2，PCV2基因。M，DL2000 DNA Marker;1，PCV3 gene;2，PCV2 gene.圖1 目的基因的PCR擴增結果Fig.1 Amplification of the target genes by PCR

采用上述優(yōu)化的反應條件，分別以8個稀釋度(1.0×10拷貝·μL～1.0×10拷貝·μL)的PCV2和PCV3標準品為模板進行熒光定量PCR擴增，以不同濃度標準品的對數(shù)值為橫坐標，反應循環(huán)數(shù)為縱坐標繪制PCV2和PCV3的標準曲線(圖2)，二者標準曲線的斜率分別為-3.258和-3.408，相關系數(shù)分別為0.995和0.996，線性關系良好。

圖2 TaqMan熒光定量PCR檢測標準曲線Fig.2 The standard curve of TaqMan fluorescence quantitative PCR

2.3 特異性試驗結果

將建立的雙重熒光定量方法對PRRSV、PRV、PPV、CSFV、PEDV、TGEV、PCV2、PCV3進行檢測，結果顯示，僅PCV2和PCV3呈陽性，其余均為陰性，表明該檢測方法特異性良好(圖3)。

2.4 敏感性試驗結果

以10倍系列稀釋的標準品為模板，用建立的雙重熒光定量PCR方法進行檢測，結果表明，該檢測方法所能檢測的PCV2和PCV3的最低檢測濃度均為10 拷貝·μL(圖4)，而常規(guī)PCR對PCV2重組質粒標準品最低檢測限為10拷貝·μL，對PCV3為10拷貝·μL(圖5)。表明該方法敏感性優(yōu)于常規(guī)PCR，敏感性較高。

1，豬圓環(huán)病毒2型；2，豬圓環(huán)病毒3型；3，豬繁殖與呼吸綜合征??；4，偽狂犬病病毒；5，豬細小病毒；6，豬瘟病毒(CSFV)；7，豬流行性腹瀉病毒；8，豬傳染性胃腸炎病毒；9，ddH2O。1，PCV2;2，PCV3;3，PRRSV;4，PRV;5，PPV;6，CSFV;7，PEDV;8，TGEV;9，ddH2O.圖3 雙重熒光定量PCR特異性檢測結果Fig.3 Specificity detection results of duplex fluorescence quantitative PCR

1～8，pMD-PCV2質粒濃度為1.0×108～1.0×101拷貝·μL-1；9，PCV2陰性對照；a～h，pMD-PCV3質粒濃度為1.0×108～1.0×101拷貝·μL-1；i，PCV3陰性對照。下同。1-8，1.0×108-1.0×101 copies·μL-1 of pMD-PCV2;9，PCV2 negative control;a-h，1.0×108-1.0×101 copies·μL-1 of pMD-PCV3;i，PCV3 negative control.The same as below.圖4 雙重熒光定量PCR敏感性檢測結果Fig.4 Sensitivity detection results of duplex fluorescence quantitative PCR

2.5 重復性試驗結果

分別以倍比稀釋的質粒標準品混合物作為模板進行組內和組間的重復性試驗，結果顯示，PCV2和PCV3的所有重復樣品的組內和組間的變異系數(shù)(CV)均小于2%(表1)，表明該檢測方法重復性良好。

表1 PCV2與PCV3標準品可重復性試驗Table 1 Reproducibility test of PCV2 and PCV3 standard products

2.6 臨床樣品檢測結果

將采集的浙江省181份豬肉及全血樣品用建立的雙重熒光定量PCR方法檢測(表2)，結果顯示，樣品中PCV2陽性檢出率為50.83%(92/181)，PCV3陽性檢出率為37.57%(68/181)，PCV2與PCV3混合感染陽性檢出率為12.15%(22/181)。普通熒光PCR檢測結果顯示PCV2陽性檢出率為50.28%(91/181)，PCV3陽性檢出率為36.46%(66/181)，PCV2與PCV3混合感染陽性檢出率為11.60%(21/181)，根據(jù)金標準計算符合率的方法(標準檢測方法與本文中建立的檢測方法檢出陽性樣品數(shù)的比值)，兩種方法檢測PCV2和PCV3的符合率分別為98.91%和97.06%，PCV2和PCV3混合感染符合率為95.45%，表明所建立的雙重熒光定量PCR檢測方法與國家標準普通熒光PCR檢測符合率較高，可用于臨床檢驗。

1～8，pMD-PCV2質粒濃度為1.0×108～1.0×101拷貝·μL-1；9，PCV2陰性對照；a～h，pMD-PCV3質粒濃度為1.0×108～1.0×101拷貝·μL-1；i，PCV3陰性對照。1-8，1.0×108-1.0×101copies·μL-1 of pMD-PCV2;9，PCV2 negative control;a-h，1.0×108-1.0×101copies·μL-1 of pMD-PCV3;i，PCV3 negative control.圖5 普通PCR敏感性檢測結果Fig.5 Sensitivity detection results of ordinary PCR

表2 臨床樣品的檢測結果Table 2 Test results of clinical samples

3 討論

豬圓環(huán)病毒感染在臨床上多引起皮炎腎病綜合征和繁殖障礙等疾病，PCV2和PCV3均具有易感性，常通過呼吸道和消化道等途徑感染豬群，各年齡段的豬群均易感且發(fā)病癥狀各不相同，常與其他傳染性病毒交叉感染給養(yǎng)殖業(yè)帶來威脅。并且研究發(fā)現(xiàn)，PCV2與PCV3兩種致病型也?；旌细腥荆瑑烧咭鸬呐R床癥狀相似，給臨床診斷帶來一定難度。因此，需要一種檢測手段對其進行鑒別。

隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展，已有多種檢測手段能對PCV2和PCV3進行特異性檢測，尤其是熒光定量PCR的發(fā)展，對臨床檢測有重要意義。我國已有針對PCV2病原的熒光定量PCR標準檢測方法，但目前尚未有對PCV2和PCV3檢測的OIE標準，使得臨床上PCV2和PCV3的檢測受限，并且目前也沒有針對PCV2和PCV3的雙重熒光定量PCR檢測方法來對其進行區(qū)別。因此，本研究設計了一種雙重熒光定量檢測方法能精準地檢測出圓環(huán)病毒2型和3型，對PCV2和PCV3的早期鑒別診斷有重要意義。

本研究以PCV2和PCV3的重組質粒為標準品模板進行PCR擴增，結果顯示，可擴增出曲線，當模板濃度為10 拷貝·μL時仍可檢測到熒光信號；對比文獻[7]中普通二重PCR檢測方法，本研究建立的檢測方法不需跑膠驗證更高效便捷，無試劑對人體造成毒害作用，且只能特異性地擴增出圓環(huán)病毒，其他病毒均呈陰性；對比文獻[6]普通PCR核酸檢測只能單一檢測出PCV2，本研究可對PCV2和PCV3進行特異性區(qū)分；對比文獻[9]中建立的多克隆抗體檢測方法造價低，更適用于針對臨床中大批量樣品的檢測；另外本研究中應用的man探針技術比文獻[8]中染料法檢測精度更高并能對PCV2與PCV3進行特異性區(qū)分。因此，本研究中建立的雙重熒光定量檢測方法對PCV2與PCV3的鑒別診斷及流行病學檢測提供了新的試驗依據(jù)，對臨床檢測有重要的應用價值。

4 結論

本文建立的針對豬圓環(huán)病毒2型和3型的TaqMan雙重熒光定量檢測方法，可以同時、快速、特異性地檢測出PCV2和PCV3，通過對其的試驗檢測，結果顯示，該檢測方法特異性良好，僅能檢測出PCV2和PCV3陽性，其他病毒均為陰性。最低檢測極限PCV2和PCV3均能達到10 拷貝·μL，靈敏性良好。組內和組間的變異系數(shù)均小于2%，可重復性良好。181份來自浙江省臨床樣品的PCV2和PCV3的檢測陽性符合率分別為98.91%和97.06%，PCV2和PCV3混合感染陽性符合率為95.45%，適用于臨床樣品的檢測。因此，本研究建立的PCV2和PCV3雙重熒光定量檢測方法對于臨床上的早期檢測具有一定實際意義，對于PCV2和PCV3的預防和控制具有重要價值。