劉莉莉，高何璇 ，楊亞文，包瑩瑩，何玉琴，*，楊志杰，陳衛(wèi)剛，葛文博

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州銀行 網(wǎng)絡(luò)金融部，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

高原甘加藏羊是典型的季節(jié)性發(fā)情哺乳動(dòng)物，生活在甘南藏族自治州海拔2 800 m以上的青藏高原天然草場(chǎng)高寒牧區(qū)，是甘肅優(yōu)良的地方品種，也是我國(guó)寶貴的畜牧資源。甘加藏羊2.5歲開(kāi)始配種，發(fā)情周期平均為(16±2)d，每年產(chǎn)羔一次，每次一羔，繁殖率低，影響了藏羊農(nóng)牧業(yè)的快速發(fā)展。因此，研究與藏羊繁殖生理活動(dòng)有關(guān)的生殖激素的調(diào)控作用機(jī)理，提高繁殖率擴(kuò)大種群內(nèi)優(yōu)秀種羊數(shù)量，對(duì)甘肅草地畜牧業(yè)的發(fā)展具有非常重要的意義。

甲狀腺激素(thyroid hormone，TH)包括三碘甲腺原氨酸 (triiodothyronine，T3)、四碘甲腺原氨酸 (thyroxine，T4)。TH 通過(guò)其特異性受體THRβ(thyroid hormone receptor β，THRβ)對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、生殖活動(dòng)等具有重要的調(diào)控作用。THRβ屬于核受體超家族成員。有文獻(xiàn)報(bào)道，THRβ在人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物下丘腦弓狀核、室旁核、視上核及腹正中核等與生殖和代謝有關(guān)的核團(tuán)上有特別高的表達(dá)，在黃金倉(cāng)鼠整個(gè)發(fā)育過(guò)程中下丘腦、垂體、睪丸、卵巢有THRβ的表達(dá)。T3可以通過(guò)THRβ對(duì)下丘腦的黑色素瘤轉(zhuǎn)移抑制基因()表達(dá)和親吻素(kisspeptin)的蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響，而基因通過(guò)其特異性G蛋白偶聯(lián)受體54(GPR54)直接作用于GnRH神經(jīng)元調(diào)控GnRH的脈沖釋放，進(jìn)而影響促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)的分泌，對(duì)哺乳動(dòng)物初情期的啟動(dòng)，發(fā)情排卵等生殖活動(dòng)發(fā)揮著重要作用。以上報(bào)道提示，TH及THRβ參與調(diào)控哺乳動(dòng)物的繁殖活動(dòng)。但目前有關(guān)TH及其THRβ對(duì)甘加藏羊繁殖活動(dòng)的調(diào)控研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次從基因和蛋白水平對(duì)甘加藏羊發(fā)情周期和乏情期松果體、HPO軸組織中mRNA及其蛋白的表達(dá)和分布規(guī)律進(jìn)行了研究，以期為進(jìn)一步闡明TH對(duì)藏羊生殖活動(dòng)的調(diào)控及其機(jī)理研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

在甘加藏羊非繁殖季節(jié)(3—4月)和繁殖季節(jié)(7—9月)，于甘肅省甘南藏族自治州夏河縣甘加鄉(xiāng)海拔2 800 m以上的藏綿羊養(yǎng)殖合作社隨機(jī)選擇2.5～3.5歲雌性健康且未孕的雌性甘加型藏綿羊30只，分為5組，每組6只。在藏羊繁殖季節(jié)，參照四期分法，根據(jù)公羊爬跨試情以及陰道脫落細(xì)胞圖片觀察，將發(fā)情周期分為發(fā)情期(0—36 h)、發(fā)情后期(39—72 h)、間情期(4—13 d)、發(fā)情前期(14—16 d)。在藏羊非繁殖季節(jié)，確定乏情期為試驗(yàn)對(duì)照組。采用頸部局部麻醉頸動(dòng)脈放血法無(wú)痛處死試驗(yàn)羊，將處死的試驗(yàn)羊迅速解剖，取出各時(shí)期松果體、下丘腦、垂體、卵巢等組織。將所取組織平均分為2份：一份置于液氮速凍后移至-80 ℃冰箱，備用；另一份置于4%多聚甲醛中固定，備用。

1.2 甘加藏羊松果體和HPO軸組織THRβ mRNA檢測(cè)

依照RNA提取試劑盒(北京，TransGen)說(shuō)明書(shū)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行操作，分別提取甘加藏羊發(fā)情周期和乏情期松果體、下丘腦、垂體和卵巢組織中的總RNA，并測(cè)定RNA濃度和純度，將測(cè)定好的總RNA溶液分別稀釋至500 ng·μL。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京，TransGen)，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈。根據(jù)NCBI中綿羊和-mRNA CDS區(qū)序列利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并由上海生工生物科技有限公司合成引物(表1)。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，RT-qPCR反應(yīng)總體系為20 μL：模板1 μL，上、下游引物各0.8 μL，2×TransStartm Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，ddHO 7.4 μL。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃ 退火延伸30 s，循環(huán)次數(shù)45次。所得相關(guān)數(shù)據(jù)用2方法進(jìn)行計(jì)算，每個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量均以?xún)?nèi)參基因?yàn)榛鶞?zhǔn)進(jìn)行校正。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平選定為=0.05。

表1 THRβ和β-actin基因引物序列Table 1 Primers sequences of THRβ and β-actin gene

1.3 甘加藏羊松果體和HPO軸組織THRβ蛋白檢測(cè)

用蛋白裂解液(1 mL裂解液+10 μL蛋白酶抑制劑)(Bioss，北京)提取各組織總蛋白，以BCA試劑盒(Bioss，北京)測(cè)定濃度，于十二烷基硫酸鈉(sodium dodecy sulfate，SDS)上樣緩沖液中100 ℃水浴 10 min 變性蛋白，冰上靜置5 min備用。制備12%封底膠、12%分離膠和5%濃縮膠后以6 μL上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳完畢對(duì)照Marker預(yù)染條帶切取THRβ(53 kDa)、β-actin(42 kDa)對(duì)應(yīng)條帶，濕轉(zhuǎn)法將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Solarbio，北京)上。PBST(PBS+tween 20)(Bioss，北京)洗膜20 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。孵育一抗(1∶500)，4 ℃過(guò)夜。PBST洗膜4 h，37 ℃孵育二抗(1∶4 500)1 h，PBST洗膜4 h，暗室曝光成影拍照。利用Image Pro-Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析，并利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行差異性分析。

1.4 甘加藏羊松果體和HPO軸組織THRβ免疫組織化學(xué)染色

將4%甲醛固定好的松果體、下丘腦、垂體、卵巢組織包埋制作5 μm厚石蠟切片，常規(guī)脫蠟處理后微波法抗原修復(fù)10 min，再用3% HO濕盒37 ℃孵育15 min，正常山羊血清工作液(A液)37 ℃封閉15 min，THRβ一抗稀釋液(兔抗羊，1:350)，陰性對(duì)照組一抗用PBS代替，4 ℃孵育過(guò)夜后37 ℃孵育1 h，然后用生物素標(biāo)記的二抗(B液，山羊抗兔IgG)37 ℃孵育15 min，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素親和工作液(C液)37 ℃孵育15 min。每次孵育后均用PBS(0.01 mol·L，pH=7.4)洗滌3次，每次5 min。DAB顯色1 min，蘇木精復(fù)染1 min，返藍(lán)，脫水透明后中性樹(shù)膠封片。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果用Motic SK210型光學(xué)顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘加藏羊松果體、HPO軸組織中THRβ mRNA及其蛋白表達(dá)分析

RT-qPCR、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，甘加藏羊發(fā)情周期和乏情期松果體、下丘腦、垂體、卵巢組織中均有mRNA和蛋白的表達(dá)，且各時(shí)期表達(dá)差異明顯(圖1和圖2)。松果體中mRNA和蛋白表達(dá)量均在乏情期最高，顯著(<0.05)高于發(fā)情周期；下丘腦中mRNA表達(dá)量在發(fā)情后期最高，與其他各時(shí)期差異顯著(<0.05)，蛋白表達(dá)量在間情期最高，與乏情期差異不顯著(>0.05)，與其他3個(gè)時(shí)期差異顯著(<0.05)；垂體中mRNA和蛋白表達(dá)量均在間情期最高，其中蛋白表達(dá)量在間情期與發(fā)情前期差異不顯著(>0.05)，其他各時(shí)期差異均顯著(<0.05)；卵巢中mRNA和蛋白表達(dá)量均在發(fā)情后期最高，與其他各時(shí)期差異顯著(<0.05)。

A，松果體;B，下丘腦;C，垂體;D，卵巢。同一系列柱上無(wú)相同字母的表示各時(shí)期mRNA或蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異顯著(P<0.05)。A，Pineal gland;B，Hypothalamus;C，Pituitary;D，Ovary.Bars marked without the same letters on the same series indicated significant differences in the relative expression of mRNA or protein at different periods at P<0.05.圖1 甘加藏羊發(fā)情周期和乏情期松果體和HPO軸組織中THRβ mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression of THRβ mRNA and protein in Pineal gland and HPO axis during estrus cycle and anestrus of Ganjia Tibetan sheep

2.2 THRβ免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物在甘加藏羊松果體和HPO軸組織中的分布

免疫組化試驗(yàn)結(jié)果顯示，松果體、HPO軸組織中THRβ免疫反應(yīng)產(chǎn)物為黃色或棕黃色，分布細(xì)胞漿和細(xì)胞核，所有對(duì)照組試驗(yàn)的標(biāo)本均呈陰性，證明所用抗體具有THRβ免疫反應(yīng)的特異性。

THRβ免疫陽(yáng)性產(chǎn)物松果體組織中主要分布在松果體細(xì)胞胞漿(圖3中A～E)，細(xì)胞呈卵圓形或圓形，其中在發(fā)情后期(圖3中C)著色深、強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。下丘腦組織中THRβ主要分布在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、大神經(jīng)元胞體和椎體細(xì)胞胞漿中有陽(yáng)性表達(dá)(圖3中F～J)，其中在發(fā)情前期(圖3中F)和發(fā)情期(圖3中G)陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)，染色深。在腺垂體組織中，THRβ主要分布在嗜酸性和嗜堿性細(xì)胞胞漿(圖3中K～O)，其中在發(fā)情期(圖3中L)弱著色，在其它四個(gè)時(shí)期有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)、濃染。卵巢組織中，THRβ免疫陽(yáng)性細(xì)胞在卵泡顆粒層、卵泡內(nèi)膜、黃體細(xì)胞中均有分布(圖3中P～T)，其中在顆粒層細(xì)胞和黃體細(xì)胞免疫陽(yáng)性產(chǎn)物著色深，高表達(dá)。

3 結(jié)果與討論

本研究結(jié)果表明，甘加藏羊發(fā)情周期各個(gè)時(shí)期和乏情期mRNA及其蛋白在松果體 和HPO軸組織中的相對(duì)表達(dá)量呈動(dòng)態(tài)變化，且存在一定的差異，這種表達(dá)的差異從基因和蛋白水平證明了THRβ參與甘加藏羊生殖調(diào)控，為進(jìn)一步研究甲狀腺激素及其受體對(duì)動(dòng)物生殖生理活動(dòng)的調(diào)控機(jī)制提供了科學(xué)的參考依據(jù)。

3.1 甘加藏羊松果體組織中的THRβ表達(dá)對(duì)藏羊繁殖的影響

PE，發(fā)情前期；E，發(fā)情期；ME，發(fā)情后期；DE，間情期；AE，乏情期。PE，Proestrus;E，Estrus;ME，Metestrus;DE，Diestrus;AE，Anestrus.圖2 甘加藏羊發(fā)情周期和乏情期松果體、HPO軸中THRβ的蛋白含量Fig.2 Content of THRβprotein in pineal gland and HPO axis during estrus cycle and anestrus of Ganjia Tibetan sheep

松果體是動(dòng)物體內(nèi)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌器官，光周期和季節(jié)變化可以調(diào)節(jié)松果體節(jié)律性分泌褪黑素(MT)來(lái)調(diào)控動(dòng)物的生殖等活動(dòng)，MT作用于垂體結(jié)節(jié)部的促甲狀腺激素和脫碘酶解碼外界光信號(hào)，并通過(guò)血液中TH 與作用于下丘腦內(nèi)側(cè)基底部(MBH)正中隆起上的甲狀腺激素受體結(jié)合，從而激活整個(gè)HPO軸，調(diào)控HPO軸相關(guān)生殖激素的變化。有研究報(bào)道顯示，松果體分泌的MT對(duì)TH具有調(diào)節(jié)作用，張明泉等以人和大鼠作為研究對(duì)象，以對(duì)光線敏感的松果體為突破口，證實(shí)冬夏季節(jié)機(jī)體內(nèi)TH的變化與松果體的高位調(diào)節(jié)有關(guān)?？涤衩鞯韧ㄟ^(guò)去除大鼠松果體，觀察大鼠甲狀腺形態(tài)和TH分泌功能的變化，證實(shí)松果體可能通過(guò)抑制大鼠甲狀腺分泌TH來(lái)調(diào)控動(dòng)物的繁殖活動(dòng)。目前已有報(bào)道顯示，TH及其受體THRβ對(duì)動(dòng)物的生殖活動(dòng)具有調(diào)控作用，尤其在啟動(dòng)和終止季節(jié)性發(fā)情哺乳動(dòng)物的發(fā)情過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。本研究首次對(duì)藏羊松果體組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，THRβ在甘加藏羊整個(gè)發(fā)情周期和乏情期松果體組織的松果體細(xì)胞胞漿均有陽(yáng)性表達(dá)，其中在發(fā)情后期強(qiáng)表達(dá)。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，甲狀腺激素受體(THR)屬于核受體，T3 通過(guò)結(jié)合到胞核內(nèi)的THRβ 而起作用。但已有研究報(bào)道指出，在大鼠背側(cè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞中，TH被證實(shí)可通過(guò)與胞漿內(nèi)THRβ結(jié)合，并快速激活 PI3K/AKT-mTOR 信號(hào)通路，且這種快速激活是不依賴(lài)于蛋白質(zhì)和 RNA 的合成，而本研究也證實(shí)THRβ是在甘加藏羊松果體細(xì)胞胞漿發(fā)揮其調(diào)控作用，提示TH也可產(chǎn)生非基因組效應(yīng)。且mRNA及其蛋白表達(dá)量在發(fā)情前期到發(fā)情期呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，從間情期開(kāi)始呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在乏情期表達(dá)最高，THRβ在松果體組織中的這種動(dòng)態(tài)差異表達(dá)提示其參與調(diào)控藏羊的發(fā)情周期生殖活動(dòng)。

3.2 甘加藏羊HPO軸組織中的THRβ表達(dá)對(duì)藏羊繁殖的影響

雌性哺乳動(dòng)物的生殖生理活動(dòng)受HPO軸的調(diào)控，且有多種激素和其它因子的協(xié)調(diào)參與，其中下丘腦GnRH的脈沖式分泌是激活動(dòng)物發(fā)情周期的關(guān)鍵，其脈沖釋放增加引起青春期啟動(dòng)，升高的LH作用于卵巢產(chǎn)生雌二醇(E2)，促進(jìn)青春期發(fā)育與成熟，對(duì)維持正常的性功能和生殖功能起重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦內(nèi)注射T3能影響 LH 分泌，而LH是HPO軸調(diào)控動(dòng)物季節(jié)性動(dòng)情節(jié)律的關(guān)鍵激素，提示T3可能參與調(diào)控季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物的繁殖活動(dòng)。已有研究證實(shí)在黃金倉(cāng)鼠HPGA發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中其下丘腦、垂體、卵巢中均有THRβ的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，THRβ在甘加藏羊發(fā)情周期各個(gè)時(shí)期HPO軸組織中均有表達(dá)，且不同組織THRβ的表達(dá)量有顯著差異，提示THRβ參與調(diào)控甘加藏羊的生殖活動(dòng)。對(duì)下丘腦組織免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，在下丘腦的神經(jīng)細(xì)胞和椎體細(xì)胞中均有THRβ陽(yáng)性表達(dá)，證實(shí)下丘腦組織中THRβ是在這兩種細(xì)胞中發(fā)揮其生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，mRNA的相對(duì)表達(dá)量從發(fā)情前期開(kāi)始呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在發(fā)情后期達(dá)到最大值，而蛋白表達(dá)量在間情期達(dá)到最大值?；蚝偷鞍妆磉_(dá)出現(xiàn)偏差的主要原因一方面可能是基因表達(dá)的內(nèi)源機(jī)制，另一方面可能是由于一些特殊外在環(huán)境因素所影響，比如藏羊高海拔的生存環(huán)境等可能對(duì)藏羊機(jī)體中從基因到蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響。已有研究證實(shí)在嚙齒動(dòng)物和綿羊大部分下丘腦KISS1細(xì)胞均表達(dá)雌激素受體α(ERα)，而雌激素的反饋?zhàn)饔谜怯上虑鹉X中 Kisspeptin-GPR54信號(hào)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)，T3可以通過(guò)THRβ對(duì)下丘腦中GT1-7神經(jīng)元細(xì)胞的1 基因表達(dá)產(chǎn)生影響，且T3缺乏可引起發(fā)育期大鼠大腦基因表達(dá)的升高，由此提示卵巢分泌的雌激素在發(fā)情后期和間情期通過(guò)調(diào)控下丘腦THRβ的表達(dá)量來(lái)影響GT1-7神經(jīng)元基因的表達(dá)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)下丘腦 GnRH 的反饋調(diào)節(jié)，影響垂體FSH和LH的分泌，調(diào)控動(dòng)物的生殖活動(dòng)。

A、F、K、P，發(fā)情前期；B、G、L、Q，發(fā)情期；C、H、M、R，發(fā)情后期；D、I、N、S，間情期；E、J、O、T，乏情期。P，松果體細(xì)胞；BV，血管；GC，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；NC，神經(jīng)元；Nu，神經(jīng)細(xì)胞核；AC，嗜酸性細(xì)胞；BC，嗜堿性細(xì)胞；CC，嫌色細(xì)胞；FA，卵泡腔；GV，卵母細(xì)胞核；LC，黃體細(xì)胞；TF，卵泡膜；SG，顆粒層。A，F(xiàn)，K，P，Proestrus;B，G，L，Q，Estrus;C，H，M，R，Metestrus;D，I，N，S，Diestrus;E，J，O，T，Anestrusl.P，Pineal cell;BV，Blood vessel;GC，Glial cell;NC，Nerve cell;Nu，Neuronuclei;AC，Acidophilic cell;BC，Basophilic cell;CC，Chromophobe cell;FA，F(xiàn)ollicular antrum;GV，Germinal vesicle;LC，Luteal cell;TF，Theca folliculi;SG，Stratum granulosum.圖3 甘加藏羊發(fā)情周期和乏情期松果體和 HPO軸組織中THRβ免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物分布Fig.3 Location of THRβ immunoreactive products of in pineal and HPO axis of Ganjia Tibetan sheep during the estrus cycle and anestrus

垂體作為機(jī)體內(nèi)重要的內(nèi)分泌腺，接受來(lái)自下丘腦分泌的GnRH，促進(jìn) FSH和LH的分泌，進(jìn)而影響卵巢性激素的合成和分泌，參與調(diào)控動(dòng)物的生殖生理活動(dòng)。Hodin等人在大鼠垂體中檢測(cè)到T3的功能性受體mRNA的表達(dá)。而本研究結(jié)果顯示，在垂體組織的遠(yuǎn)側(cè)部的嗜酸性細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞的細(xì)胞漿中均有THRβ的陽(yáng)性表達(dá)，其基因和蛋白表達(dá)量均從發(fā)情前期開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在發(fā)情期達(dá)到最小值，之后開(kāi)始呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在間情期達(dá)到最大值，提示THRβ在垂體組織中主要在間情期的嗜酸性和嗜堿性細(xì)胞中參與調(diào)控甘加藏羊生殖活動(dòng)。主要原因可能是雌激素的反饋調(diào)節(jié)。已有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠垂體前葉中檢測(cè)到T3的功能性THRβ，而垂體前葉是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素合成和分泌的區(qū)域，其分泌的LH是下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)控雌性動(dòng)物發(fā)情、排卵等生殖活動(dòng)的橋梁，且包瑩瑩等的研究發(fā)現(xiàn)，在藏羊垂體組織中也檢測(cè)到基因和蛋白的表達(dá)，而THRβ能誘導(dǎo)ERα的轉(zhuǎn)錄，接受來(lái)自性腺激素的反饋調(diào)節(jié)，再次證實(shí)本研究結(jié)果。

卵巢作為主要的雌性生殖器官，對(duì)下丘腦和垂體所釋放的生殖激素較為敏感，其釋放的E2轉(zhuǎn)而調(diào)控自身或?qū)Υ贵w和下丘腦進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，繼而參與機(jī)體生殖過(guò)程。Vissenberg等人發(fā)現(xiàn)，在卵巢上存在甲狀腺激素受體和甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，其通過(guò)對(duì)105篇文獻(xiàn)灰度總結(jié)，數(shù)據(jù)顯示甲狀腺激素水平的改變影響卵泡發(fā)育、精子生成，降低受孕率，T3 可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，并通過(guò) PI3K/Akt信號(hào)通路抑制其凋亡。本研究對(duì)藏羊的卵巢進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)在卵巢組織的卵泡顆粒細(xì)胞胞漿和胞核、卵泡內(nèi)膜細(xì)胞及黃體細(xì)胞胞漿中均有THRβ的陽(yáng)性表達(dá)，其中在卵泡顆粒層細(xì)胞和黃體細(xì)胞胞漿有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，提示THRβ參與調(diào)控卵泡的發(fā)育和黃體的成熟。而文獻(xiàn)報(bào)道顯示卵巢分泌的雌激素的反饋?zhàn)饔檬峭ㄟ^(guò)Kisspeptin/GPR54信號(hào)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的，而T3能通過(guò)THRβ影響1基因啟動(dòng)子活性來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA 表達(dá)和 Kisspeptin 蛋白表達(dá)的調(diào)控。而本研究也證實(shí)mRNA和蛋白表達(dá)量均在發(fā)情后期達(dá)到最大值，在乏情期達(dá)到最小值，由此提示卵巢中THRβ可能通過(guò)卵巢中的雌激素反饋?zhàn)饔糜谙虑鹉Xkisspeptin，參與GnRH脈沖釋放的神經(jīng)內(nèi)分泌過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)性腺系統(tǒng)的繁殖調(diào)控。且有研究證實(shí)在甘加藏羊整個(gè)發(fā)情周期卵巢顆粒細(xì)胞上存在雌激素受體(ERs)、KISS1和GPR54的表達(dá)。綜上所述，THRβ主要在發(fā)情后期調(diào)控甘加藏羊的生殖活動(dòng)，參與調(diào)控卵泡發(fā)育和排卵等生殖活動(dòng)。