涂遠航，李珊珊，陳 策，丁秀麗

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行，全球約有2.57億慢性HBV感染者。亞洲多數(shù)地區(qū)為中至高流行區(qū)[1]。據(jù)估計，每年大約有 100 萬人死于HBV相關的并發(fā)癥。因此，積極探索HBV 持續(xù)性感染的機制，有助于建立更有針對性的治療方法，從而清除慢性感染者體內(nèi)HBV。目前普遍認為，T淋巴細胞介導的細胞免疫對HBV的清除起關鍵作用[2]，但T淋巴細胞的活化需要共刺激分子及其配體的正常表達，異常的共刺激信號影響慢性乙型病毒性肝炎病人的免疫應答[3]。目前，研究較為廣泛、 深入并取得重要進展的協(xié)同刺激分子是CD28家族成員，CD28家族成員包括CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4、BTLA，其中CD28 和 ICOS 對于T淋巴細胞的活化起關鍵作用。目前，CD28和ICOS在人類HIV 感染中的研究最為廣泛和深入[4-5]，但在慢性乙型病毒性肝炎中的研究報道相對較少。因此，本研究通過觀察慢性乙型病毒性肝炎病人外周血中CD28、ICOS 分子的表達，分析其與HBV持續(xù)感染及病情進展的關系，以期為臨床治療慢性乙型病毒性肝炎提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年3月至2019年8月蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院感染科及解放軍902醫(yī)院肝病中心收治的慢性乙型病毒性肝炎住院病人56例作為觀察組，另納入同期20名健康體檢者作為對照組，2組一般資料均具有可比性。慢性乙型病毒性肝炎診斷以中國《慢性乙型肝炎防治指南(2015年)》 作為標準。排除合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染及自身免疫相關疾病，入院前均未接受過抗病毒和免疫治療。

1.2 實驗方法

1.2.1 外周血單個核細胞的采集和保存 所有受試者均清晨空腹采集外周血10 mL，室溫下 EDTA 抗凝，及時(6 h 內(nèi))行流式細胞術檢測。

1.2.2 流式細胞術分析 采用Epics XL型流式細胞儀檢測外周血CD4+、CD8+T細胞，以及CD4+、CD8+T 細胞中 CD28、ICOS的表達水平，采用Kaluza Analysis軟件分析各細胞亞群的比例(CD4%、CD8%、CD4+CD28+%、CD8+CD28+%、CD4+ICOS+%、CD8+ICOS+%)。流式細胞儀及分析軟件均為美國Beckman coulter公司產(chǎn)品；檢測試劑由解放軍902醫(yī)院肝病中心實驗室提供。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 2組外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞水平 2組外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞及CD4+/CD8+差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 2組外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞水平比較

2.2 T淋巴細胞表面CD28的表達水平 觀察組外周血CD4+CD28+T 細胞、CD8+CD28+T 細胞水平均明顯低于對照組(P<0.01)(見表2)。

表2 2組外周血不同T淋巴細胞表面CD28的表達水平比較

2.3 T淋巴細胞ICOS的表達水平 2組CD4+ICOS+T細胞水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；觀察組CD8+ICOS+T細胞水平明顯高于對照組(P<0.01)(見表3)。

表3 2組外周血不同T淋巴細胞表面 ICOS 的表達水平比較

3 討論

人體感染HBV后，會出現(xiàn)兩種情況，一種是機體特異免疫被激活，病毒被清除；另一種是機體長期攜帶病毒，免疫與病毒共存，造成持續(xù)慢性感染[6]。HBV能否被有效清除，T細胞介導的細胞免疫起重要作用[7-8]，但T細胞的激活需要雙信號，單純的T細胞表面受體-抗原肽-MHC分子的相互作用并不能誘導T細胞的活化，還需要 CD28、ICOS 、CD137等協(xié)同刺激受體[9]，CD28、ICOS通過激活磷脂酰肌醇3-激酶等途徑，影響細胞因子的合成和存活[10]，同時促進T細胞活化、白細胞介素等細胞因子的生產(chǎn)，并發(fā)揮免疫效應[11]。

正常情況下，機體CD4+和CD8+T淋巴細胞比例穩(wěn)定在一定水平，以維持機體免疫功能穩(wěn)態(tài)，但HBV感染會打破這種平衡。近些年，國內(nèi)外對慢性乙肝外周血T淋巴細胞亞群研究較多，但報道的結(jié)果并不一致。黃云麗等[12]對144例乙肝病人T淋巴細胞亞群分析發(fā)現(xiàn)，從急性乙型病毒性肝炎、慢性乙型病毒性肝炎到乙型病毒性肝炎導致的肝硬化病人CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞計數(shù)呈現(xiàn)逐漸減少趨勢，肝硬化組CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞計數(shù)均少于急、慢性乙肝組及正常對照組。吳昊等[13]研究果表明，隨著慢性乙肝病情的發(fā)展，CD3+、CD4+T淋巴細胞絕對數(shù)有明顯減少趨勢，而CD8+T淋巴細胞在慢活肝組中并不降低；孫永年等[14]研究則發(fā)現(xiàn)慢性乙肝及肝硬化組CD8+T淋巴細胞高于正常對照組。由于現(xiàn)有的研究結(jié)果不一致，無法確定HBV 持續(xù)性感染是否與CD4+、CD8+T淋巴細胞數(shù)量下降或兩者比例異常有關，因此本研究觀察了CD4+、CD8+T淋巴細胞數(shù)量及比例，結(jié)果顯示，慢性乙型肝炎組CD4+和CD8+T淋巴細胞及兩者間的比例與健康對照組差異無統(tǒng)計學意義。既然慢性乙肝病人的CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)量及比例未出現(xiàn)異常，那么CD4+和CD8+T淋巴細胞是否存在功能上的缺陷呢？本研究進一步觀察共刺激分子CD28及ICOS在T細胞上的表達情況，發(fā)現(xiàn)CD28分子在慢性乙肝病人外周血中CD4+和CD8+T淋巴細胞的表達明顯下降，這提示相當一部分T淋巴細胞由于缺乏共刺激信號不能被激活，而只能處于無功能狀態(tài)或進入凋亡[15-16]。而ICOS在兩個不同T細胞亞群中的表達與CD28并不一致，ICOS在慢性乙肝病人CD8+T淋巴細胞上表達明顯增高，甚至高于健康對照組，而在CD4+T淋巴細胞上并未發(fā)現(xiàn)明顯上調(diào)。盡管ICOS與CD28同屬于CD28 家族成員，但兩者亦存在很大差異。CD28表達于T細胞表面，主要為T細胞激活提供必要的信號，而ICOS則表達于已經(jīng)活化的CD4+和CD8+T淋巴細胞表面，與其配體ICOSL相互作用，促進T細胞分泌大量細胞因子，包括IL-4、IL-5、IL-10、γ-干擾素等[17-18]。本研究中，ICOS在CD4+和CD8+T淋巴細胞的這種差異化表達，可能會導致CD8+T異常激活甚至出現(xiàn)功能亢進，而CD4+T淋巴細胞因缺乏足夠的協(xié)同刺激信號，功能則相對較弱，其結(jié)果與CD4+和CD8+T淋巴細胞比例失衡相似，這種細胞功能上的失衡同樣會導致HBV難以清除；同時由于ICOS在CD8+T淋巴細胞上的過度表達，會導致CD8+T細胞功能亢進，誘發(fā)肝組織反復、持續(xù)炎癥，導致肝組織病變逐漸加重。

綜上，慢性乙型肝炎病人同時存在免疫低下和免疫紊亂。免疫低下主要與T淋巴細胞表面CD28表達減少有關，而免疫紊亂則主要由ICOS在CD4+、CD8+T淋巴細胞上的不均衡分布所致。免疫低下導致HBV持續(xù)感染、難以清除；免疫紊亂則導致慢性HBV病人出現(xiàn)持續(xù)的肝組織損傷。因此如何提高慢性乙型肝炎病人T淋巴細胞表面CD28的表達，同時避免ICOS在不同淋巴細胞亞群的不均衡分布，對于清除HBV、減輕肝組織損傷具有重要意義。