陳廣業(yè)，楊 清

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，2018年全球新增180萬例，死亡862 000例[1]。近年來結(jié)腸癌的發(fā)病率呈上升之勢[1]。盡管根治性手術(shù)和輔助化療可以提高結(jié)腸癌病人的生存率，但是腫瘤復發(fā)仍然是預后不良的主要原因[2]。尋找結(jié)腸癌潛在的分子生物學指標是臨床和基礎研究的重點。

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)是一類胞內(nèi)接頭蛋白，主要參與腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)受體家族信號通路的調(diào)控，具有影響細胞增殖、存活、凋亡、參與免疫炎癥反應等多種功能[3]。TRAF家族共7個成員，分別為TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRAF7，其中TRAF4作用較為獨特，它能同時作為TNF受體家族和Toll樣/白細胞介素1受體家族的接頭分子[3]。TRAF4在人體各種組織中均有表達，既往研究顯示TRAF4可能作為促癌基因在乳腺癌[4]、宮頸癌[5]和非小細胞肺癌[6]等腫瘤中發(fā)揮作用。TRAF4可表達于結(jié)腸組織[7]，然而其在結(jié)腸癌中的表達及臨床意義既往少有報道。本研究用免疫組織化學染色法檢測結(jié)腸癌組織中TRAF4的表達，探討其與結(jié)腸癌臨床病理特征及預后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 樣本來源 選取2009年1月至2010年10月在我院進行手術(shù)切除的112例結(jié)腸癌組織標本及其配對的癌旁組織標本(距離腫瘤邊緣至少5 cm的正常腸黏膜組織)。組織石蠟標本均由我院病理科完成，厚度為4 μm。納入標準：(1)組織病理學檢查證實為結(jié)腸癌；(2)年齡≥18歲；(3)病例資料完整。排除標準：(1)嚴重的心肝腎功能異常；(2)合并其他部位腫瘤；(3)家族性腺瘤性息肉病或Lynch綜合征。112例中男45例，女67例；年齡44～81歲。所有病人隨訪截至2019年1月。

1.2 免疫組織化學染色法檢測組織中TRAF4的表達 本研究所用SP免疫組化試劑盒購于上海信裕生物科技有限公司，實驗時嚴格按照試劑盒說明書進行操作。將結(jié)腸癌組織和癌旁組織石蠟切片在70 ℃下烤片30 min，隨后進行脫蠟處理。用Tris/EDTA修復液進行抗原修復，隨后用羊血清封閉30 min。加入TRAF4兔抗人多克隆抗體(1∶1 000稀釋，美國Santa Cruz公司)，4 ℃過夜，加入生物素標記的山羊抗小鼠IgG(1∶500稀釋，艾美捷科技有限公司)，37 ℃孵育30 min。用辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液和DAB顯色液進行處理，蘇木紫復染。經(jīng)過脫水、透明、封片后在IX71型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)下觀察。

由我院兩位病理科醫(yī)師進行獨立閱片，兩人結(jié)果一致則記錄結(jié)果，如有爭議則請第三位醫(yī)師看片，以兩個相同結(jié)果為準。每張切片隨機選擇10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞。染色為陰性計0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細胞數(shù)為0%～10%計1分，11%～50%計2分，51%～80%計3分，81%～100%計4分。將上述兩個評分相乘，對TRAF4表達情況進行評價：0分(陰性)，1～3分(弱陽性)，4～8分(中等陽性)，9～12分(強陽性)。0～3分為低表達，4～12分為高表達[8]。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用χ2檢驗、Kaplan-Meier法、Log-rank檢驗和COX回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 TRAF4在結(jié)腸癌組織中的表達 TRAF4主要表達于細胞核中(見圖1)。結(jié)腸癌組織中TRAF4高表達率為73.21%(82/112)，明顯高于癌旁組織的33.04%(37/112)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=38.81，P<0.01)。

2.2 TRAF4表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系 低分化結(jié)腸癌病人的TRAF4高表達率明顯高于高分化病人(P<0.01)，T分期越高，TRAF4高表達率越大(P<0.01)，M1期結(jié)腸癌病人的TRAF4高表達率明顯高于M0期病人(P<0.01)。不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、肉眼分型、組織學類型、N分期的TRAF4表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 TRAF4表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系[n;百分率(%)]

續(xù)表1

2.3 結(jié)腸癌病人預后的影響因素分析 多因素分析結(jié)果顯示，分化程度、T分期、N分期、M分期和TRAF4是結(jié)腸癌病人總體生存時間的獨立影響因素(P<0.05)，分化程度、N分期、M分期和TRAF4是結(jié)腸癌病人無進展生存時間的獨立影響因素(P<0.05)(見表2、3)。

表2 結(jié)腸癌病人總生存時間的影響多因素分析

表3 結(jié)腸癌病人無進展生存時間的單因素和多因素分析

2.4 TRAF4與結(jié)腸癌病人生存預后的關(guān)系 高表達組總體生存率和無進展生存率分別為64.29%和69.64%，均低于低表達組的82.43%和90.18%(χ2=3.15、4.92，P<0.05)。高表達組中位生存時間和無進展生存時間分別為70.92個月和72.55個月，均低于低表達組的84.81個月和89.66個月(uc=3.71、5.00,P<0.05)。

3 討論

結(jié)腸癌是威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移的機制較為復雜。TRAF4是一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)的E3鏈接酶，最早是通過乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的cDNA文庫篩選出來的有差異表達的基因[9]。越來越多研究顯示，TRAF4可作為促癌基因在腫瘤性疾病中發(fā)揮作用，例如乳腺癌[4]、宮頸癌[5]、非小細胞肺癌[6]、子宮內(nèi)膜癌[10]、肝細胞癌[11]和食管鱗癌[12]。既往研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細胞系中TRAF4高表達，并且可以促進癌細胞的增殖、侵襲和遷移。TRAF4在結(jié)腸癌組織中的表達及臨床意義既往少有報道。本研究采用免疫組織化學染色法檢測了112例結(jié)腸癌組織及其配對的癌旁組織中TRAF4的表達，結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中TRAF4高表達率明顯高于癌旁組織。

TRAF4作為促癌基因在腫瘤中的作用機制尚未完全明確。SINGH等[15]發(fā)現(xiàn)，TRAF4可以介導神經(jīng)生長因子受體TkkA的泛素化，進而促進調(diào)節(jié)前列腺癌的轉(zhuǎn)移。TRAF4可調(diào)控多條信號通路，參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，例如PI3K/AKT/Oct4信號通路[16]、PRMT5信號通路[17]和Wnt/β-catenin信號通路[18]等。另外TRAF4還可作為miRNA的下游靶基因而發(fā)揮作用[5,19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，TRAF4與結(jié)腸癌的分化程度、T分期和M分期有關(guān)。提示TRAF4在結(jié)腸癌進展中發(fā)揮重要作用。本研究未發(fā)現(xiàn)TRAF4與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、肉眼分型、組織學類型和N分期有關(guān)。影響結(jié)腸癌病人預后的因素有很多，本研究發(fā)現(xiàn)分化程度、T分期、N分期、M分期是影響結(jié)腸癌病人生存預后的獨立影響因素，這與既往報道一致[8,20-21]。COX多因素分析證實TRAF4與結(jié)腸癌病人不良預后有關(guān)，TRAF4高表達組的總生存時間和無進展生存時間均低于低表達組，提示TRAF4可能會成為結(jié)腸癌預后的評價指標。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中TRAF4高表達率明顯高于癌旁組織，TRAF4與結(jié)腸癌分化程度、T分期、M分期有關(guān)。TRAF4高表達預示著結(jié)腸癌病人的不良生存預后，有可能成為結(jié)腸癌的分子生物學指標。本研究存在一些局限性，例如未檢測病人血清中TRAF4的表達水平，其對結(jié)腸癌診斷和鑒別診斷的價值需要未來進一步分析；未深入分析TRAF4在結(jié)腸癌中的作用機制。