臨床上很多常見的晚期腫瘤（乳腺癌、前列腺癌以及肺癌等）都會發(fā)生骨轉移，并且75%骨轉移病人經(jīng)歷著嚴重的疼痛（cancer-induced bone pain,骨癌痛）。腫瘤在骨中生長的過程中能夠導致疼痛、高鈣血癥、貧血、感染以及骨折等，嚴重影響了病人的生活質量。

這世上確實有人文理兼修，感性與理性并重。知識的自行車，騎得越平衡，越不會摔倒。而現(xiàn)在，我們已經(jīng)在路上了。

對骨癌痛機制的研究表明，它是一種包含神經(jīng)病理性疼痛和炎癥性疼痛成分的混合疼痛狀態(tài)，但對周圍組織和神經(jīng)的改變又明顯不同于神經(jīng)病理性疼痛和炎癥性疼痛，在脊髓水平也有其獨特的神經(jīng)化學變化。骨髓、礦化骨和骨膜受神經(jīng)纖維的高度支配，當癌細胞侵入并開始增殖時，初級傳入纖維的機械損傷、擴張和壓迫會導致神經(jīng)病理性疼痛。腫瘤是由腫瘤細胞以及間充質細胞組成的，后者包括巨噬細胞、中性粒細胞、T 細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞等。腫瘤以及間充質細胞能夠分泌各種生長因子、細胞因子、白細胞介素、趨化因子、前列腺素、內(nèi)皮素和其他有助于疼痛發(fā)生或維持的炎癥介質。這些炎癥介質可直接或間接激活初級傳入纖維或者脊髓背角上的傷害性感受神經(jīng)元，從而導致骨癌痛的發(fā)生。臨床上超過一半的轉移性癌痛病人報告，目前的藥物療法不能充分緩解疼痛，說明癌痛有其獨特的一面。因此，目前還迫切需要開發(fā)新的鎮(zhèn)痛療法，為癌癥病人提供緩解疼痛和改善生活質量的姑息治療。這就需要研究人員聚焦到腫瘤本身，特別是腫瘤分泌釋放的一系列外分泌蛋白上，因為它們是腫瘤和傷害性感受器相互作用的橋梁。

為了驗證滿量程標定的準確性，該項目使用了200個20 kg砝碼，合計4 t的標準砝碼加在秤體上進行檢驗，并對數(shù)據(jù)進行了記錄，見表6所列。可以看出，秤的準確度較高，完全符合設計及工藝要求。

腫瘤基因組學、蛋白組學、表觀遺傳學等的研究產(chǎn)生了大量的突變和基因表達等數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)大多儲存在美國國家癌癥研究所TCGA (The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫中。本研究將運用生物信息學技術，挖掘TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌和肺腺癌分泌組蛋白的基因表達情況，以期能夠篩選出腫瘤新的致痛分子，同時探討采用生物信息學技術對組學數(shù)據(jù)挖掘從而篩選新的分子靶點的可行性。

方 法

1.研究方案及數(shù)據(jù)獲取

首先，通過GEPIA2網(wǎng)站對來源于TCGA數(shù)據(jù)庫的人類乳腺癌 (BRCA) 和肺腺癌 (LUAD) 基因表達數(shù)據(jù)進行分析。和正常樣本相比，乳腺癌樣本中有1422個基因表達上調(diào)，2124個基因表達下調(diào)；肺腺癌中1106個基因表達上調(diào)，3133個基因表達下調(diào)。在表達上調(diào)的基因中，乳腺癌和肺腺癌表達變化一致的基因有578個；而在表達下調(diào)的基因中，乳腺癌和肺腺癌表達變化一致的基因有1349個（見圖2）。

2.數(shù)據(jù)分析

隨后，將乳腺癌和肺腺癌中表達變化一致的基因（上調(diào)或下調(diào)）分別與人分泌蛋白組對應基因進行比對，發(fā)現(xiàn)86個分泌蛋白對應基因在乳腺癌和肺腺癌中一致上調(diào)，而244個分泌蛋白對應基因在乳腺癌和肺腺癌中一致下調(diào)（見圖2）。將這330個基因及其在乳腺癌中的表達數(shù)據(jù)作為分泌組蛋白差異基因表達數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析?；鹕綀D展示了這330個基因在乳腺癌中的表達差異及其顯著性（見圖3）。另外，表1展示了乳腺癌中前20個上調(diào)最明顯的外分泌蛋白基因。其中包含膠原蛋白家族3個成員（COL10A1、COL11A1和COL1A1）、基質金屬蛋白酶家族3個成員(MMP11/9/13)、趨化因子CXCL家族3個成員(CXCL10/9/13)以及免疫球蛋白γ重鏈3個成員(IGHG4/1/3)。

結 果

1.人乳腺癌和肺腺癌差異表達基因結果

人乳腺癌和肺腺癌表達基因數(shù)據(jù)分別來源于TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov)中BRCA和LUAD隊列，其差異表達基因數(shù)據(jù)通過GEPIA2(http://gepia2.cancer-pku.cn) 數(shù)據(jù)庫進行分析、下載獲取。Log(fold change) 絕對值和q-value值分別設置為1和0.05。人分泌組 (Secretome) 蛋白基因列表數(shù)據(jù)從人類蛋白數(shù)據(jù)集 (https://www.proteinatlas.org)網(wǎng)站獲取，總計2793個基因。研究方案見圖1。

2.人乳腺癌和肺腺癌中分泌組蛋白的基因表達結果

采用R studio軟件 (v1.3.1093)，通過R語言進行數(shù)據(jù)處理。主要使用Tidyverse和limma包進行數(shù)據(jù)分析，隨后使用EnhancedVolcano包進行火山圖繪制。采用clusterProfiler包進行KEGG 通路富集分析，不同數(shù)據(jù)的交集韋恩圖使用VennDiagram包進行繪制。

3. KEGG通路富集分析結果

隨后對這330個分泌組蛋白差異表達基因進行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)20條通路其基因表達改變有顯著性差異（校正后＜ 0.05），包括細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、PI3K-Akt通路、白介素-17 (interleukin, IL-17) 信號通路、TNF信號通路等（見圖4A）。其中，前2條信號通路差異基因最多（各26個），圖4B展示了細胞因子及其受體相互作用通路26個基因的表達情況，其中CXCL家族多個成員(CXCL9/10/13)表達呈明顯上調(diào)。這其中，CXCL10、IL-6及TNF-α等多個蛋白已被報道參與了骨癌痛的發(fā)生和維持。

本研究采用生物信息學技術，通過挖掘乳腺癌和肺腺癌分泌蛋白組基因表達的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)細胞因子及其受體相互作用等20條通路其基因表達具有顯著差異。其中CXCL家族多個成員 (CXCL9/10/13)表達呈明顯上調(diào)。這與文獻報道的骨癌痛模型中CXCL10表達明顯上調(diào)一致。CXCL9/10/13的共同受體是CXCR3，研究發(fā)現(xiàn)CXCR3的激活參與了骨癌痛的發(fā)生。另外，也有文獻報道了CXCL1、CXCL12等家族其他成員參與了骨癌痛的發(fā)生和維持。白介素也是一類重要的致痛物質，多項研究 表 明IL-1β、IL-6、IL-10以 及IL-18等參與了骨癌痛的發(fā)生和維持。本研究篩選出白介素家族的2個成員（IL-6和IL-33）在腫瘤中的表達下調(diào)。需要注意的是，本研究中組學數(shù)據(jù)篩選基于轉錄組測序，也就是mRNA的表達情況，與真實的蛋白表達可能不太一致，也有可能是因為IL-6和IL-33的大量翻譯導致mRNA的耗竭造成的。

討 論

為了驗證該系統(tǒng)可使用性和擴展性，實驗模擬了系統(tǒng)在局域網(wǎng)下的數(shù)據(jù)分布式存證。測試環(huán)境為：在局域網(wǎng)內(nèi)，部署了4臺linux服務器，同時運行服務端程序，與客戶端進行數(shù)據(jù)同步交互。

在本研究的通路富集結果中，PI3K-Akt通路同樣有26個基因表達差異顯著。既往的研究表明，骨癌痛中初級傷害性感受神經(jīng)元、脊髓背角、中腦導水管周圍灰質等多個部位均有PI3K-Akt通路的激活，說明該通路的激活對于骨癌痛的發(fā)生和維持是至關重要的。PI3K-Akt通路是多種細胞因子（如CXCL10、IL-6和MCP-1）與其受體相互作用的下游通路，該通路的改變與細胞因子及其受體相互作用通路的改變是一致的。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一類負責切割細胞外基質(extracellular matrix, ECM)蛋白質的主要蛋白酶家族。MMPs在骨中的作用包括成骨細胞/骨細胞分化、骨形成、骨吸收過程中類骨的溶解、破骨細胞的募集和遷移，以及生理條件下骨的重塑。在本研究中，基質金屬蛋白酶家族3個成員(MMP11/9/13)均在乳腺癌和肺腺癌中表達明顯上調(diào)。它們的上調(diào)有利于骨微環(huán)境的重塑、腫瘤對骨的侵襲和轉移。

目標公司盡職調(diào)查應重點關注其是否合法取得營業(yè)執(zhí)照、是否按照當?shù)囟悇找舐男屑{稅義務、是否取得項目投資所需開發(fā)許可、審核目標公司章程是否對股權變更有相關限制性規(guī)定、目標公司原股東間如有股東協(xié)議也應重點審查、目標公司資本注入情況、目標公司是否設立分支機構代表處、資產(chǎn)抵質押情況、債務情況、項目資產(chǎn)情況(包括有形資產(chǎn)與無形資產(chǎn))、目標公司是否面臨相關訴訟糾紛等。

本研究主要基于組學數(shù)據(jù)的篩選，缺乏后期基于動物實驗數(shù)據(jù)的驗證，這是本研究存在的主要不足。通過文獻回顧，發(fā)現(xiàn)本研究所取得的主要發(fā)現(xiàn)可以在部分文獻中得到驗證，說明采用生物信息學技術挖掘組學數(shù)據(jù)可作為一種行之有效的目標基因篩選方法。本研究還篩選出其他幾十個分泌蛋白組基因的表達明顯上調(diào)，這些蛋白是否會參與癌痛的發(fā)生和維持需要更進一步的實驗驗證。

綜上所述，通過乳腺癌和肺腺癌表達數(shù)據(jù)分析篩選出了一些潛在的致痛基因和信號通路，采用生物信息學篩選靶基因是一種簡便、易行的方法。