神經(jīng)病理性疼痛 (neuropathic pain, NP) 是由軀體感覺系統(tǒng)損傷或疾病導(dǎo)致的一種慢性疼痛，主要表現(xiàn)為痛覺過敏、痛覺異常、持續(xù)或間歇的自發(fā)性疼痛和非疼痛的異常感覺。病情反復(fù)發(fā)作，經(jīng)久不愈，常伴有抑郁、焦慮等情緒問題，不僅嚴重影響病人的睡眠、人際交往和日常生活，而且對社會造成了極大的經(jīng)濟負擔。NP具有眾多復(fù)雜的潛在分子機制，難以實施標準化的治療。目前常用的治療藥物有抗抑郁類藥物、抗驚厥藥、阿片類鎮(zhèn)痛藥、局部麻醉藥以及非甾體抗炎藥等，其多通過阻止神經(jīng)信號傳遞而發(fā)揮短暫效應(yīng)，且伴有惡心、嗜睡、頭暈，及阿片類藥物治療后產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛耐受性和成癮性等不良反應(yīng)。因此，NP的治療在世界范圍內(nèi)仍是一個棘手的問題，進一步探究NP潛在的分子機制及新的治療靶點具有重要意義。

9.1.1菜青蟲 以幼蟲在葉背或心葉危害，1～2齡幼蟲啃食葉肉，在葉片上留下一層薄而透明的表皮，3齡以上幼蟲將葉片咬出孔洞，或?qū)⑷~片邊緣吃成缺刻，嚴重時將全部葉片吃光，并排出糞便，污染菜心，嚴重影響產(chǎn)量和質(zhì)量。該蟲一年發(fā)生4～6代，世代重疊，危害持續(xù)時間長。

近年來的研究數(shù)據(jù)表明，許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程不僅有神經(jīng)元細胞參與，非神經(jīng)元細胞如單核細胞、巨噬細胞、T細胞和膠質(zhì)細胞等也發(fā)揮著重要作用。其中，中樞神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的小膠質(zhì)細胞活化被證實與NP的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，這可能成為當前關(guān)于NP治療研究的一個重要突破點。外周神經(jīng)損傷后小膠質(zhì)細胞胞體腫脹、突起回縮，隨即大量增殖，釋放大量細胞促炎因子并介導(dǎo)脊髓背角中疼痛的傳遞。研究證實，抑制小膠質(zhì)細胞的活化可有效緩解NP。

鞣花丹寧 (ellagitannins, ETs) 是一種酚類化合物，可以從石榴、黑莓、漿果、堅果等食物中攝取。ETs龐大的化學(xué)結(jié)構(gòu)不易擴散，因而難以被胃部吸收，經(jīng)腸道微生物分解為鞣花酸、沒食子酸、尿石素A(urolithin A, UA) 等相關(guān)化合物。UA具有抗氧化、抗炎、抗衰老和抗腫瘤等多種生物活性，且多項研究證實UA可顯著抑制TNF-α、IL-1β及IL-16等促炎性細胞因子的釋放。然而，目前關(guān)于UA是否能夠通過抑制細胞促炎因子的釋放從而緩解NP尚不清楚。因此，本研究采用慢性壓迫性損傷模型(chronic construction injury, CCI) 小鼠作為研究對象，通過腹腔注射UA探究其對NP的影響及其可能的作用機制。

但需要注意的是，等離子手術(shù)對病例篩選嚴格，術(shù)前需通過相關(guān)檢查全力分期病變，對侵犯較廣的和分化較低的病理類型仍應(yīng)選擇開喉手術(shù)，以降低復(fù)發(fā)率；且低溫等離子微創(chuàng)手術(shù)熱效率低，其止血效果有限，遇到動脈性出血時必須謹慎處理。

方 法

1. 實驗動物

對于這樣的“突然襲擊”，這位老師表現(xiàn)得異常鎮(zhèn)定，他先把問題推還給學(xué)生：“大家小組討論討論”；再把問題推給作者和編者：“同學(xué)們一起來改改教材，再給編輯叔叔寫封信”；最后當學(xué)生問蚌如何能說話，兩個殼是不是它的嘴的時候，又讓學(xué)生上網(wǎng)或去圖書館查資料，或者去請教自然老師，或者設(shè)法弄只蚌來自己觀察發(fā)現(xiàn)。

2. 實驗藥物及試劑

UA購自上海一基實業(yè)有限公司；Iba-1和相應(yīng)二抗購自美國的Abcam公司，TNF-α、IL-1β及IL-6的ELISA檢測試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

3. CCI小鼠的制備

腹腔注射1%戊巴比妥(3 mg/kg)麻醉小鼠，右側(cè)大腿備皮，術(shù)區(qū)消毒鋪巾，平行于股骨下方3～4 mm處做一個長1 cm左右的皮膚切口，鈍性分離肌層，暴露坐骨神經(jīng)，游離坐骨神經(jīng)干大約10 mm，將3根浸泡于生理鹽水的4-0絲線從坐骨神經(jīng)下方穿過，結(jié)扎三道，每個結(jié)間隔約1 mm。結(jié)的松緊度以可以看到肌肉短暫的抽搐、線不會在坐骨神經(jīng)上滑動為宜，后逐層縫合肌肉、皮膚。Sham組小鼠僅分離暴露坐骨神經(jīng)但不進行結(jié)扎，其余操作相同。CCI模型小鼠造模成功后可見小鼠手術(shù)側(cè)活動時出現(xiàn)跛行，休息時足不接觸地面，足內(nèi)收，外翻，震顫等。Sham組小鼠術(shù)后未見異?；顒?、運動障礙等表現(xiàn)。所有小鼠均在手術(shù)3天后開始給藥。

4. 實驗動物分組

據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，每3人中就有1人遭受急性或慢性疼痛，在普通人群中，NP的發(fā)生率為6.9%～10%。65%的創(chuàng)傷性神經(jīng)疾病病人均患有疼痛，其中50%的病人被診斷為神經(jīng)病理性疼痛。通過抑制小膠質(zhì)細胞活化緩解NP是不同于經(jīng)典理論的新方向。本研究結(jié)果顯示，UA能夠有效緩解CCI小鼠的熱痛覺過敏和機械痛覺過敏，且UA抑制了CCI小鼠脊髓背角小膠質(zhì)細胞的活化及細胞促炎因子的釋放。

雄性SPF級健康 C57BL/6J小鼠，8 周齡，體重19～21 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。所有動物飼養(yǎng)和實驗操作程序符合動物實驗倫理委員會相關(guān)規(guī)定，并通過徐州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審查（倫理審查號：201909A010）。

5. 機械痛閾的測定

測定MWT來反映小鼠的機械痛閾。本實驗使用的Frey細絲包括：0.02、0.07、0.16、0.4、0.6、1.0、1.4和2.0 g。將小鼠放置到10 cm×10 cm×15 cm的有機玻璃盒中，每次實驗前適應(yīng)約0.5 h。小心將Frey細絲置于小鼠腳底并使其彎曲，保持彎曲3～4 s，且同一只小鼠的同一側(cè)腳掌的相鄰2次刺激之間需間隔10 min。初次刺激時使用克度為0.16的Frey細絲。按照up-down方法進行測試，測試從1.0 g刺激強度開始當小鼠腳掌出現(xiàn)敏銳的抬腳反應(yīng)，則為陽性反應(yīng)，在Frey表中記作X。反之，則為陰性反應(yīng)，記作O。從出現(xiàn)陰、陽性反應(yīng)變化開始，共進行6次試驗。試驗結(jié)束后，用50%Frey反應(yīng)閾值公式計算出小鼠的縮足閾值。MWT于實驗之前、實驗第3、5、7、14天分別進行測試。

6. 熱痛閾的測定

將小鼠深麻醉（腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg），在冰上迅速取出脊髓腰膨大段 (L)，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑的混合液（體積比500:1）進行勻漿，4℃下12,000 r/min離心20 min，取上清進行蛋白定量后溶解于蛋白上樣緩沖液。組織全蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后以半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST在室溫下封閉2 h，加入TNF-α、IL-1β、IL-6或GAPDH的一抗在4℃孵育過夜，經(jīng)過TBST洗膜后，加入偶聯(lián)HRP的二抗于室溫下孵育45 min，用TBST洗膜。最后，通過ECL檢測系統(tǒng)獲得蛋白條帶，使用圖像分析系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。

7. 免疫熒光染色

采用SPSS 16.0軟件包進行統(tǒng)計分析，痛閾值分析采用重復(fù)測量的方差分析，灰度值比較采用單因素方差分析，組間比較方差齊性時采用LSD法，計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤 (±)表示，＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

8. ELISA檢測

小鼠深麻醉（腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg）后，在冰上迅速取出脊髓腰膨大段 (L)，按組織凈重 (g) :稀釋液體積 (ml) = 1:9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水進行勻漿，4℃下3500 r/min離心10 min，提取上清液并在-80℃保存。按試劑盒說明書檢測蛋白并繪制標準曲線，計算出脊髓TNF-α、IL-1β及IL-6濃度。

9. Western Blot檢測

測定TWL來反映小鼠的熱痛閾。將小鼠放在6 mm厚有機玻璃板上，用PL-200型全自動熱痛刺激儀（成都泰盟科技有限公司）光源焦距通過有機玻璃板照射動物后肢足底掌心， 電子秒表記錄從照射開始至引起撤足反應(yīng)的時間為熱痛覺觀測指標，讀數(shù)精確到0.01 s。取每只小鼠5次測量結(jié)果的均值為統(tǒng)計數(shù)據(jù)，測量間隔時間至少5 min。事先調(diào)節(jié)光照強度，使平均時間約10 s，上限為 20 s，避免造成組織損傷。TWL于實驗之前、實驗第3、5、7、14天分別進行測試。

10. 統(tǒng)計學(xué)分析

腹腔注射1%戊巴比妥(3 mg/kg)將小鼠麻醉后，經(jīng)心臟灌注生理鹽水沖去血液，再用4℃的4%多聚甲醛溶液灌注固定。取其L腰椎脊髓，在4%的多聚甲醛中繼續(xù)后固定1～3 h。將所有樣品在30%蔗糖溶液中脫水2天。冷凍在-20℃的OCT中，用冰凍切片機 (Leica CM1900) 將組織切成25 μm的薄片，先用PBS洗滌，然后置于含10%驢血清的0.3%Triton X-100溶液中常溫固定1 h，再孵育小膠質(zhì)細胞特異性標記物Iba-1抗體4℃過夜，洗滌后常溫避光孵育FITC偶聯(lián)的IgG，用熒光顯微鏡和CCD掃描相機 (Olympus)拍照。

免疫熒光結(jié)果顯示，在手術(shù)后第7天，Sham組小鼠脊髓背角Iba-1表達較少，CCI組小鼠脊髓背角Iba-1表達明顯增多 (＜ 0.05)，提示CCI組小鼠脊髓背角小膠質(zhì)細胞明顯增多，給予腹腔75 mg/kg UA注射后，CCI小鼠脊髓背角Iba-1表達增多被明顯逆轉(zhuǎn)（＜ 0.05，見圖2），提示UA可以抑制CCI小鼠脊髓背角小膠質(zhì)細胞的激活。

結(jié) 果

1. UA對CCI小鼠熱痛閾和機械痛閾的影響

為了去除耐受性差異較大的個體，排除不可控干擾因素，在造模前對所有小鼠進行MWT測定，選擇基礎(chǔ)痛閾無統(tǒng)計學(xué)差異的小鼠進行分組及后續(xù)實驗（痛閾檢測和UA注射時間點見圖1A）。與Sham組小鼠相比，手術(shù)后第3天，造模小鼠 MWT和TWL均顯著降低 (＜ 0.05)，并且一直持續(xù)到第14天，提示CCI小鼠造模成功（見圖1）。與CCI組小鼠相比，CCI + UA組小鼠能夠明顯提高CCI小鼠的痛閾，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (＜ 0.05)。腹腔注射75 mg/kg和100 mg/kg UA緩解疼痛的效果均顯著強于腹腔注射50 mg/kg UA，而腹腔注射75 mg/kg UA與100 mg/kg UA對于疼痛的緩解無顯著性差異，因而后續(xù)研究選取CCI + 75 mg/kg UA組。以上結(jié)果表明UA能減輕CCI小鼠的熱痛覺過敏（見圖1B）和機械痛覺過敏（見圖1C）。

2. UA對CCI小鼠脊髓背角Iba-1表達的影響

現(xiàn)在，我們住進了樓房，獨輪車也失去應(yīng)有的風(fēng)光?？筛赣H舍不得把它處理掉，還收藏在樓下車庫的一角。每過兩三個月，父親就去把車子擦一遍，車軸里還上點油，然后望著它，摸摸它，還自言自語地說著什么。

3. UA對CCI小鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白表達的影響

ELISA結(jié)果顯示，在手術(shù)后第7天，與Sham組相比，CCI組小鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β及IL-6表達顯著升高 (＜ 0.05)，與CCI組相比，腹腔注射75 mg/kg UA后，CCI小鼠脊髓TNF-α、IL-1β及IL-6的表達增多被明顯逆轉(zhuǎn)（＜ 0.05，見圖3A-C）。上述結(jié)果表明，UA可以抑制CCI小鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β及IL-6的表達。Western Blot結(jié)果顯示，在手術(shù)后第7天，與Sham組相比，CCI組小鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β及IL-6表達顯著升高 (＜ 0.05)，與CCI組相比，腹腔注射75 mg/kg UA后，CCI小鼠脊髓TNF-α、IL-1β及IL-6的表達增多被明顯逆轉(zhuǎn)（＜ 0.05，見圖3D-G），與ELISA檢測結(jié)果一致。綜上表明，UA可以抑制CCI小鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β及IL-6的表達。

討 論

選取C57BL/6J 8周雄性小鼠50只，采用隨機數(shù)字表法分為 3 組。假手術(shù)組（Sham組，10只）小鼠在手術(shù)后第4天開始隔天腹腔注射10%DMSO溶劑至第14天；模型組（CCI組，10只）小鼠在手術(shù)后第4天開始隔天腹腔注射10%DMSO溶劑至第14天；CCI + UA組（CCI + 50、75和100 mg/kg UA組，每個濃度各10只）小鼠在手術(shù)后第4天開始隔天腹腔注射UA至第14天。手術(shù)前、后第 3、5、7、14天使用Frey測痛儀和熱測痛儀測定小鼠機械刺激縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT) 及熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)，第14天行為學(xué)檢測時間在UA腹腔注射4 h后。采用免疫熒光方法檢測小鼠脊髓背角Iba-1的含量，采用ELISA檢測小鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β和IL-6表達。

農(nóng)業(yè)機械化是提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率的重要措施。受制于科技技術(shù)和地區(qū)經(jīng)濟條件，部分地區(qū)農(nóng)業(yè)機械化推進速度緩慢。平原地區(qū)擁有發(fā)展大規(guī)模機械化農(nóng)業(yè)的自然資源和社會資源，農(nóng)業(yè)機械化發(fā)展水平較高。萬州區(qū)是丘陵地形，受地理、水文條件限制，不適合發(fā)展大規(guī)模機械化農(nóng)業(yè)。此外，受到經(jīng)濟水平、社會制度、政府政策等因素的限制，萬州區(qū)很難實現(xiàn)發(fā)達地區(qū)那種普遍的大規(guī)模機械化生產(chǎn)。

有研究表明，青年會出現(xiàn)更嚴重的NP，而且臨床上70%的疼痛病人為女性，但為了實驗中避免發(fā)情期對雌性產(chǎn)生的影響，大多數(shù)臨床前研究都是在雄性嚙齒動物中進行的。此外，有數(shù)據(jù)表明，CCI誘導(dǎo)的兩性小膠質(zhì)細胞增生和Iba-1的表達無明顯差異。因此，本研究選擇以成年雄性CCI小鼠為模型展開相關(guān)研究。UA是一種鞣花單寧類的腸道菌群代謝物，于2005年被發(fā)現(xiàn)并正式命名。在右旋糖酐硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS)誘導(dǎo)的大鼠急性結(jié)腸炎模型中，首次報道了UA的抗炎作用，即降低了炎癥標志物環(huán)氧化酶2的mRNA和蛋白水平。進一步研究表明，經(jīng)UA治療后，在三硝基苯磺酸誘導(dǎo)和DSS誘導(dǎo)的急性和慢性結(jié)腸炎小鼠模型中，血漿中細胞促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達均持續(xù)下降。Jing等的研究數(shù)據(jù)顯示，UA可降低高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠肝臟和順鉑誘導(dǎo)的腎毒性損傷小鼠腎臟中IL-1β的含量。在神經(jīng)元組織中，UA治療降低了AD模型鼠 APP/PS1小鼠大腦中IL-1β、IL-6和TNFα的水平。最近研究發(fā)現(xiàn)，小鼠炎癥性自身免疫性腦脊髓炎經(jīng)UA治療后，其白質(zhì)組織的炎性細胞浸潤減少。上述研究充分證明了UA在抗炎方面的巨大潛力。本研究的ELISA和Western Blot結(jié)果顯示，NP存在時，細胞促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6表達顯著升高，UA有效抑制了CCI小鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β及IL-6的表達增多，與既往報道中的結(jié)果一致。本研究表明UA能夠緩解CCI小鼠痛覺過敏，其機制可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。同時，UA跨物種最一致的功效是改善線粒體健康，UA在NP模型中表現(xiàn)出的鎮(zhèn)痛作用是否也與線粒體自噬有關(guān)是我們下一階段的研究方向。

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第一反應(yīng)細胞和主要駐留免疫細胞。大量研究表明，小膠質(zhì)細胞會在NP早期被激活。Iba-1是在小膠質(zhì)細胞中特異性表達的鈣結(jié)合蛋白，能夠標記小膠質(zhì)細胞靜息和活化狀態(tài)下的形態(tài)和分布，被廣泛用作小膠質(zhì)細胞特異性標記物。在本實驗中，NP存在時，Iba-1表達增多，表明小膠質(zhì)細胞數(shù)量增多，而腹腔注射UA后，Iba-1表達減少，小膠質(zhì)細胞數(shù)量減少，提示腹腔注射UA抑制了CCI小鼠脊髓背角小膠質(zhì)細胞的激活。

綜上所述，在本實驗條件下UA能夠有效緩解NP，其作用機制可能與抑制脊髓背角小膠質(zhì)細胞激活及其炎癥反應(yīng)有關(guān)，這為闡明UA調(diào)控NP的發(fā)展過程提供了實驗依據(jù)，并為臨床治療NP提供了新的思路。

地方高校在鄉(xiāng)村振興的農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新方面，可有效推進農(nóng)村農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整與升級，進而加快農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展，提高農(nóng)民生活水平。農(nóng)業(yè)科技水平直接影響著農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展速度，決定鄉(xiāng)村振興的方向、進程和質(zhì)量。地方高校作為科技創(chuàng)新體系的重要構(gòu)成部分，在農(nóng)村科技創(chuàng)新中具有重要作用。因此，通過地方高校農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新輸入農(nóng)村模式，可有效促進農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、大力提高農(nóng)民整體科技水平、加快農(nóng)村科技園區(qū)建設(shè)等各項事業(yè)的發(fā)展，最終推動鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的實施。

NP是目前較為普遍的公共衛(wèi)生問題，探討NP的治療方法及其機制具有重要的意義。本研究結(jié)果表明UA可通過抑制小膠質(zhì)細胞激活及其炎癥反應(yīng)來緩解NP，但本實驗僅檢驗了UA對于CCI小鼠誘發(fā)痛的影響，在后期需要考察UA對于CCI小鼠自發(fā)痛的影響。此外，UA在小膠質(zhì)細胞上的作用靶點也仍需進一步深入研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。