王丙萍，段金凱，高鳳英，高艷偉，高維實(shí)

010017 呼和浩特，內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 腫瘤研究所(王丙萍)，腹部腫瘤外科(高艷偉、高維實(shí));010070 呼和浩特，內(nèi)蒙古建筑職業(yè)技術(shù)學(xué)院 公共課教學(xué)部(段金凱);010010 呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院(高鳳英)

惡性腫瘤無(wú)論是在發(fā)生時(shí)還是在發(fā)展時(shí)都與宿主的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，而抗腫瘤免疫主要為細(xì)胞免疫。近年來(lái)，利用基因改造技術(shù)表達(dá)腫瘤特異性嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)的T細(xì)胞治療技術(shù)在腫瘤治療方面的研究進(jìn)展迅猛，其在體內(nèi)、體外和臨床試驗(yàn)中均顯示出良好的靶向性、殺傷性和持久性，為解決過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療的局限提供了新的有效方案，并且展示了巨大的發(fā)展前景和應(yīng)用潛力[1]。CAR技術(shù)不僅僅只是修飾T細(xì)胞，它還可以修飾CIK細(xì)胞、NK細(xì)胞以及γδT細(xì)胞等[2-4]。

前列腺癌是危害老年男性健康的常見(jiàn)癌癥之一。前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)是一種比前列腺特異性抗原更具敏感性和特異性的前列腺癌標(biāo)記物[5]，目前已經(jīng)被公認(rèn)為是前列腺癌基因治療中最具有意義的抗原及靶點(diǎn)。

病毒載體可以有效地將目的基因整合進(jìn)靶細(xì)胞基因組，并且穩(wěn)定表達(dá)，被認(rèn)為是最有希望的基因治療載體且較為常用[6]。相較于其它病毒載體，慢病毒載體具有致癌風(fēng)險(xiǎn)低、隨機(jī)整合基因風(fēng)險(xiǎn)低、生產(chǎn)成本相對(duì)較低[7-8]以及高效轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞等特點(diǎn)，是安全有效且靈活制備CAR相關(guān)細(xì)胞的最佳選擇[9]。為了臨床實(shí)驗(yàn)或后期基因功能研究，獲得高滴度的病毒以及高的感染效率是十分必要的。因此，本研究通過(guò)比較不同條件下PSMA-CAR慢病毒顆粒感染CIK細(xì)胞的效率，探討PSMA-CAR慢病毒顆粒的最佳濃縮方法以及提升感染CIK細(xì)胞效率的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胚腎細(xì)胞株HEK-293FT細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所；慢病毒載體 PSMA-CAR為前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建保存；空載體 PCDH-CAR(SBI，日本)；包裝質(zhì)粒 PsAX2、OG(華西病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))。質(zhì)粒小提試劑盒(OMEGA，美國(guó))；聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)(Ploysciences，美國(guó))；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、胰酶、opti-MEM 培養(yǎng)液(Gibco，美國(guó))；超濾管Millipore 100 kDa(Merck，德國(guó))；聚凝胺(Polybrene;Solarbio，中國(guó))；熒光標(biāo)記單克隆抗體CD3-FITC、CD8-FITC、CD56-PE(BD，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱及生物安全柜(Thermo，美國(guó))；倒置熒光顯微鏡(Leica，德國(guó))；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó));高速離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))；超速離心機(jī)(Beckman，美國(guó))；超凈工作臺(tái)(蘇州泰安空氣技術(shù)有限責(zé)任公司，中國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 慢病毒包裝 將HEK-293FT細(xì)胞以1～2×106個(gè)/孔的密度接種于10 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為10%FBS+DMEM高糖，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。病毒包裝前用新鮮預(yù)熱的DMEM高糖培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。以空載體PCDH-CAR(空載體)作為陽(yáng)性對(duì)照，PSMA-CAR慢病毒載體的用量為20 μg，慢病毒包裝質(zhì)粒PsAX2和OG的用量為各10 μg。將2 mg/mL的PEI溶液于60 ℃水浴5 min，溶解后放至室溫，將三種質(zhì)粒和PEI溶液(質(zhì)?？偭俊肞EI的比例為1∶9)分別加入到opti-MEM培養(yǎng)液中，每管溶液總量為1.5 mL，輕輕混勻，在室溫下放置5 min；將含有PEI的opti-MEM培養(yǎng)液緩慢加入到含質(zhì)粒的培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫放置20 min，將混合液輕柔逐滴加入到10 mm培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換為含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后用倒置熒光顯微鏡觀察熒光情況，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2 慢病毒顆粒的濃縮 收集48 h及72 h的HEK-293FT轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清培養(yǎng)液，4 ℃、3 000 rpm，低速離心10 min，將上清用0.45 μM濾膜進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片。此后分3種方法濃縮病毒顆粒：1)超速離心法：將過(guò)濾后的培養(yǎng)液分裝在無(wú)菌干燥的超速離心管中，放置于超速離心機(jī)中4 ℃、30 000 rpm，離心3 h。離心完成后棄培養(yǎng)液，加入300 μL的培養(yǎng)液，在4 ℃下溶解沉淀物6 h，每小時(shí)輕輕震蕩離心管數(shù)次，100 μL/管分裝并凍存于-80 ℃；2)超濾管濃縮法：將過(guò)濾后的培養(yǎng)液分裝在無(wú)菌干燥的超濾管中，每管13 mL，于4 ℃，5 000 g離心35 min，將濾膜上方剩余液體分裝100 μL/管，凍存于-80 ℃；3)PEG-8000濃縮法：將過(guò)濾后的培養(yǎng)液30 mL加入5×PEG-8000+NaCl母液7.5 mL，放于4 ℃，每20～30 min混合一次，5～6次后，于4 ℃過(guò)夜。次日4 ℃，4 000 g離心20 min，棄上清，加入300 μL DPBS溶解病毒，100 μL/管分裝并凍存于-80 ℃。

1.3.3 CIK細(xì)胞的培養(yǎng) 健康人靜脈采血15 mL，生理鹽水稀釋1倍，淋巴細(xì)胞分離液與血液體積比為1∶2.5的比例分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。培養(yǎng)基為GT-551，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，第0天加入干擾素-γ 1 000 U/mL，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第1 d加入100 U/mL的IL-1α，50 μg/mL的CD3單抗，300 U/mL的IL-2。此后每隔2 d加入培養(yǎng)基及300 U/mL的IL-2，調(diào)整細(xì)胞濃度。FITC-CD3和PE-CD56抗體染色，流式細(xì)胞儀鑒定CIK細(xì)胞。

1.3.4 慢病毒感染CIK細(xì)胞 將培養(yǎng)5～7 d生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CIK細(xì)胞接種于12孔板，密度為2×106個(gè)/孔，加入濃縮的病毒300 μL/孔，4 ng/mL的聚凝胺。此后分為兩種方法：1)直接放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2)室溫(26 ℃)、150 g低速離心4 h后再于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染48 h后通過(guò)熒光顯微鏡觀察并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染效率。

1.3.5 流式細(xì)胞檢測(cè) 1)包裝效率檢測(cè)：轉(zhuǎn)染24 h后，0.25%胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后的HEK-293FT細(xì)胞。以PCDH-CAR載體轉(zhuǎn)染后的HEK-293FT細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)PSMA-CAR載體轉(zhuǎn)染后的HEK-293FT細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)綠色熒光；2)CIK細(xì)胞鑒定：CIK細(xì)胞培養(yǎng)3～4 d后聚集成團(tuán)，出現(xiàn)集落；取出部分用DPBS洗滌，移液器將細(xì)胞吹散后用熒光標(biāo)記單克隆抗體染色(CD3-FITC，CD56-PE；CD56-PE，CD8-FITC)，洗滌細(xì)胞去除游離的熒光抗體后，上機(jī)檢測(cè)；3)CIK細(xì)胞感染效率檢測(cè)：慢病毒顆粒感染CIK細(xì)胞48 h后，取出部分細(xì)胞洗滌，移液器吹散后，用流式細(xì)胞儀的熒光素異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate,FIT)C通道檢測(cè)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，從而檢測(cè)出CIK細(xì)胞感染效率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，在P<0.05時(shí)被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PSMA-CAR慢病毒載體的包裝結(jié)果

轉(zhuǎn)染24 h后，可明顯觀察到細(xì)胞發(fā)綠色熒光(圖1)，這說(shuō)明目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，目的基因正常表達(dá)。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP的表達(dá)情況(圖2)，測(cè)定PSMA-CAR慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效率為67.71%±4.47%，對(duì)照組空載體的轉(zhuǎn)染效率為77.74%±4.98%(F=6.729，P=0.060)，兩組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 HEK-293FT細(xì)胞包裝慢病毒載體的明場(chǎng)圖和熒光圖

圖2 慢病毒包裝效率檢測(cè)流式細(xì)胞圖

2.2 CIK細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果

健康人外周血分離PBMC后，經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)為CIK細(xì)胞，第0 d為散落的顆粒狀細(xì)胞，3～4 d后聚集成團(tuán)，出現(xiàn)CIK細(xì)胞集落(圖3)。培養(yǎng)5～7 d，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定(圖4)，CD3+細(xì)胞為85.28%±17.67%，CD3+CD56+細(xì)胞為22.02%±2.68%，CD8+CD56+細(xì)胞為23.09%±6.85%，確定為CIK細(xì)胞后，進(jìn)行下一步的慢病毒感染實(shí)驗(yàn)。

圖3 CIK細(xì)胞培養(yǎng)

圖4 CIK細(xì)胞鑒定

2.3 慢病毒感染CIK細(xì)胞不同感染方法的比較

用超速離心法獲得的PSMA-CAR慢病毒濃縮顆粒感染CIK細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示：無(wú)論從CIK細(xì)胞的綠色熒光亮度上還是從感染效率上，室溫+長(zhǎng)時(shí)間低速離心步驟的加入都明顯提高了慢病毒感染CIK細(xì)胞的效率(圖5)。流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果顯示(圖6)：未加入離心步驟時(shí)，感染效率為2.73%±0.75%,加入離心步驟后，感染效率可達(dá)32.04%±1.66%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=766.84，P<0.01)。

圖5 不同方法感染CIK細(xì)胞的明場(chǎng)圖和熒光圖

圖6 不同方法感染CIK細(xì)胞的流式細(xì)胞比較

2.4 不同方法濃縮的慢病毒顆粒感染CIK細(xì)胞的比較

本研究應(yīng)用了3種方法對(duì)慢病毒顆粒進(jìn)行濃縮，用濃縮后的慢病毒顆粒感染CIK細(xì)胞，結(jié)果表明(圖7、8)，獲得的慢病毒濃縮顆粒的感染CIK細(xì)胞效率3種方法分別為超濾管濃縮法6.98%±0.77%，超速離心法32.04%±1.66%，PEG-8000濃縮法53.47%±4.72%(F=189.70，P<0.01)，3種方法之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖7 不同濃縮方法獲得的慢病毒顆粒感染CIK細(xì)胞的明場(chǎng)圖和熒光圖

圖8 不同濃縮方法獲得的慢病毒顆粒感染CIK細(xì)胞的流式細(xì)胞比較

3 討 論

前列腺癌是危害老年男性健康的常見(jiàn)癌癥之一，其發(fā)病率在我國(guó)呈明顯的逐年上升趨勢(shì)。前列腺癌具有潛伏期長(zhǎng)、發(fā)病率高的特點(diǎn)，但臨床上其早期診斷率卻很低，因此大多數(shù)患者失去了早期手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。PSMA是存在于前列腺腺上皮細(xì)胞且橫跨細(xì)胞膜的II型固有膜蛋白，由于其在前列腺癌上皮細(xì)胞尤其是在雄激素非依賴性前列腺癌及其轉(zhuǎn)移灶中有最高的表達(dá)[10]，明顯高于正常前列腺上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，并且在前列腺外的實(shí)體腫瘤供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞中也有表達(dá)，但在前列腺外的正常組織中不表達(dá)或少量表達(dá)[11]，因此可以作為前列腺組織的標(biāo)記物。

目前CAR-T細(xì)胞技術(shù)在淋巴瘤[12]、卵巢癌[13]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[14]、白血病[15]、多發(fā)性骨髓瘤[16]、乳腺癌[17]等惡性腫瘤患者的治療中均顯示出良好的抗腫瘤效應(yīng)[18-20]。CAR-T的發(fā)展十分迅速，然而應(yīng)用仍然還面臨許多困難，比如：臨床上使用的CAR-T療法所帶來(lái)的脫靶毒性、器官毒性等；腫瘤微環(huán)境的免疫抑制、抗原表達(dá)缺失或下調(diào)以及CAR-T細(xì)胞持久性不足等導(dǎo)致仍有患者復(fù)發(fā)；治療實(shí)體瘤效果不佳，不能夠有效地浸潤(rùn)到腫瘤組織內(nèi)部；CAR-T細(xì)胞生存時(shí)間不長(zhǎng)。

基于CAR-T療法的原理，研究人員通過(guò)CAR修飾CIK細(xì)胞、NK細(xì)胞以及γδT細(xì)胞等，以期解決CAR-T療法所面臨的難題。CIK細(xì)胞是以T細(xì)胞為主的非均質(zhì)細(xì)胞群，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性和NK細(xì)胞的非限制性殺瘤等優(yōu)點(diǎn)。相較于CAR-T，選用CIK這種異質(zhì)混合型的細(xì)胞[21]對(duì)于治療時(shí)易產(chǎn)生的嚴(yán)重副反應(yīng)有減輕作用。除了血液腫瘤之外，CAR-CIK細(xì)胞在實(shí)體瘤研究中也取得一定的效果。通過(guò)Her-2、EGFR[22]、CEA[23]等腫瘤潛在靶點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)體瘤的靶向殺傷。

免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不高一直是困擾其基因改造的一個(gè)難題，慢病毒載體可以像轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞一樣，高效轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞，因此其可以轉(zhuǎn)導(dǎo)更為廣泛的細(xì)胞，包括那些難轉(zhuǎn)導(dǎo)的血液前體細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[24]。本研究結(jié)果表明，在應(yīng)用慢病毒顆粒感染CIK細(xì)胞時(shí)，僅僅加入轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑聚凝胺并不能提高其感染效率，只有在加入轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑的同時(shí)，通過(guò)室溫(26 ℃)+長(zhǎng)時(shí)間(4 h)+低速離心(150 g)處理才能使轉(zhuǎn)染效率達(dá)到可觀的目標(biāo)，這與此方法增加了病毒顆粒與CIK細(xì)胞接觸的緊密度可能相關(guān)。

為了臨床實(shí)驗(yàn)或后期基因功能研究，獲得高滴度的病毒是十分必要的。而通過(guò)研究不同慢病毒載體質(zhì)粒的包裝能力，發(fā)現(xiàn)隨著插入目的片段的增長(zhǎng)，病毒滴度則呈現(xiàn)半對(duì)數(shù)形式下降，目的質(zhì)粒愈長(zhǎng)則包裝有活力病毒顆粒的能力愈下降[25]。因此當(dāng)研究的目的基因較大時(shí)，選擇優(yōu)化后的病毒包裝體系才可能得到高效率的病毒顆粒。為了產(chǎn)生足夠數(shù)量的基因工程化免疫細(xì)胞用于臨床實(shí)驗(yàn)，生產(chǎn)大量的慢病毒并進(jìn)行濃縮處理是必要的。本研究結(jié)果表明，相較于超濾管濃縮慢病毒的方法，超速離心法和PEG-8000濃縮法更能提高PSMA-CAR慢病毒的濃縮效率，并且PEG-8000濃縮法的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于超速離心法。在進(jìn)行少量病毒濃縮時(shí)，超濾管濃縮法是方便快捷的方法，但需要濃縮病毒量較多時(shí)，則需要較多耗材，費(fèi)用巨大；應(yīng)用超濾管濃縮慢病毒時(shí)需要根據(jù)包裝出慢病毒的大小選擇超濾管的型號(hào)，型號(hào)選擇不準(zhǔn)確也可能是導(dǎo)致濃縮效率不高的原因之一；此外，超濾管不只濃縮了慢病毒顆粒，還濃縮了培養(yǎng)液中的鹽離子及酸堿指示劑等成分，濃縮這些成分可能是導(dǎo)致感染后CIK細(xì)胞凋亡較多，造成感染效率不高的主要原因。超速離心法對(duì)設(shè)備和耗材的要求很高，但目前中國(guó)沒(méi)有國(guó)產(chǎn)的超速離心機(jī)，進(jìn)口超速離心機(jī)價(jià)格都很貴，并不是一般實(shí)驗(yàn)室所能配備，并且和設(shè)備相匹配的超速離心管價(jià)格也很昂貴，屬于一次性耗材，因此超速離心法不適用于大量制備慢病毒顆粒。PEG-8000濃縮法所需試劑耗材價(jià)格低廉，實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求不高，并且濃縮效率較高，是大量濃縮慢病毒顆粒的首選方法。

本研究的結(jié)果顯示，在倒置熒光顯微鏡下觀察，CIK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率比流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果要高。這可能是由于GFP吸收的光譜，最大峰值為395 nm(紫外線)，并有一個(gè)峰值為470 nm的副峰(藍(lán)光)；發(fā)射光譜最大峰值為509nm(綠光)，并帶有峰值為540 nm的側(cè)峰。GFP的光譜特性與FITC很相似，因此為熒光素FITC設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡濾光片組合同樣適用于GFP觀察；但倒置熒光顯微鏡的藍(lán)光激發(fā)濾色片為460～490 nm，其發(fā)射片波長(zhǎng)為515 nm，而流式細(xì)胞儀濾光片的488 nm激光的熒光通道則包括530/30 nm、585/42 nm、670 nm LP。這就導(dǎo)致在倒置熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果不一致。由于慢病毒包裝時(shí)的轉(zhuǎn)染為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，目的載體進(jìn)入細(xì)胞中的數(shù)量不一致，這就導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá) GFP時(shí)有強(qiáng)也有弱，應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀察時(shí)，可增大激發(fā)光的強(qiáng)度，發(fā)光較弱的細(xì)胞也能觀測(cè)到，這也可能是導(dǎo)致流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果相對(duì)低一些的原因。因此，本研究的實(shí)際轉(zhuǎn)染效率應(yīng)高于流式細(xì)胞儀所檢測(cè)的結(jié)果。

綜上所述，隨著腫瘤免疫學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程修飾免疫細(xì)胞的過(guò)繼性免疫治療，將成為治療惡性腫瘤的有效手段。本研究通過(guò)比較PSMA-CAR慢病毒顆粒感染CIK細(xì)胞的效率，探討PSMA-CAR慢病毒顆粒的最佳濃縮方法以及提升感染CIK細(xì)胞效率的最佳方法，從而為應(yīng)用CAR 技術(shù)治療前列腺癌奠定基礎(chǔ)。

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