馬 鑫，朱 濤

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，也是全球常見的三大癌癥之一[1]。2012年全球乳腺癌新增確診病例約170萬例，死亡病例約50萬例[1-2]。雖然內(nèi)分泌藥物和CDK4/6抑制劑等的使用明顯提高了乳腺癌患者的總生存率，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是尚未攻克的難題[3]。因此，對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究至關(guān)重要。有研究表明LINC00847表達(dá)異常與肝癌、腎癌以及非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展相關(guān)[4-6]。目前關(guān)于LINC00847影響乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及具體機(jī)制的報(bào)道極少。本文通過RNA干擾技術(shù)沉默乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中LINC00847的表達(dá)，探討其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響，補(bǔ)充lncRNA在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮的重要作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與試劑人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231以及人胚胎腎細(xì)胞系293T(ATCC)；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、ECORI內(nèi)切酶和AgeI內(nèi)切酶(購自賽默飛公司)；胎牛血清(FBS)(BI公司)；Trizol總RNA提取液(美國Invitrogen公司)；無EDTA胰蛋白酶(美國Life Technoiogy公司)；蛋白裂解液(碧云天生物公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(全式金生物公司)；Costar 8.0 μm孔徑Transwell小室(美國Corning公司)。

1.2 LINC00847-shRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建使用siRNA Wizard在線軟件設(shè)計(jì)LINC00847的shRNA，LINC00847-shRNA-1引物序列：5′-CCGGGCTCTAA CAAAGCCTCTGTCTGGATCCAGACAGAGGCTTTGTT AGAGCTTTTTG-3′，LINC00847-shRNA-2引物序列：5′-CCGGGATCATGGCAGTGGCATTATAGGATCCTAT AATGCCACTGCCATGATCTTTTTG-3′。退火處理：從99 ℃起逐漸降至4 ℃停止，每分鐘下降1 ℃。用Solution Ⅰ連接酶將退火產(chǎn)物與已用ECORI和AgeI酶切過純化的載體Plko.1 16 ℃連接3 h，連接結(jié)束后取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5α細(xì)胞中。挑取單菌落，搖菌6 h后抽取質(zhì)粒，酶切后跑膠鑒定然后送測(cè)序再次鑒定。

1.3 慢病毒的包裝和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建使用二代慢病毒包裝三載體(pMD2G、psPAX2和待包裝質(zhì)粒)系統(tǒng)和磷酸鈣法在293T細(xì)胞中包裝病毒，并用0.22 μm的濾膜過濾培養(yǎng)基，收取24 h和48 h的病毒。將24 h收取的病毒加入到提前種好的豐度約為50%MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)皿中感染24 h，隨后換液，加入48 h收取的病毒感染細(xì)胞24 h。換成新鮮的培養(yǎng)基，后加入2 μm嘌呤霉素篩選1周，以構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)目的質(zhì)粒的細(xì)胞系。最后收集部分細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR鑒定，檢測(cè)LINC00847被敲低后繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR使用Trizol試劑法提取細(xì)胞的總RNA。依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配好逆轉(zhuǎn)錄體系，加入1 μg新提取的總RNA按照42 ℃ 15 min的程序?qū)⑵淠孓D(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書避光配好反應(yīng)體系，然后加入cDNA混勻后放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力在超凈臺(tái)中棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞1次，胰酶消化細(xì)胞，離心后用1 mL新鮮培養(yǎng)基重懸，取100 μL細(xì)胞懸液稀釋10倍后使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后根據(jù)細(xì)胞數(shù)量稀釋成濃度為每毫升2×104個(gè)的單細(xì)胞懸液，在96孔板中每孔加入100 μL單細(xì)胞懸液，同時(shí)每個(gè)處理組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，做5個(gè)相同的96孔板連續(xù)檢測(cè)5天。24 h后棄去培養(yǎng)液，然后在每孔加入100 μL用培養(yǎng)基稀釋10倍的MTT液，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后棄去MTT液并瀝干，每孔中加入100 μL的DMSO并避光輕搖15 min。最后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀讀取96孔板各孔中OD570 nm。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成能力在超凈臺(tái)中棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞1次，胰酶消化細(xì)胞，離心后用1 mL新鮮培養(yǎng)基重懸，取100 μL細(xì)胞懸液稀釋10倍后使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后根據(jù)細(xì)胞數(shù)量稀釋成濃度為每毫升1×103個(gè)的單細(xì)胞懸液，6孔板中每孔加入2 mL上述單細(xì)胞懸液，每個(gè)處理組做3個(gè)重復(fù)孔。8天后棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入1 mL 90%乙醇固定30 min，棄去乙醇，晾干后加入1 mL結(jié)晶紫染色30 min，清洗后拍照留存。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力在超凈臺(tái)中棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞1次，胰酶消化細(xì)胞，離心后用1 mL新鮮無血清培養(yǎng)基重懸，取100 μL細(xì)胞懸液稀釋10倍后使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后根據(jù)細(xì)胞數(shù)量稀釋成濃度為每毫升5×105個(gè)細(xì)胞的無血清單細(xì)胞懸液。分別取200 μL單細(xì)胞懸液加入到無和有Matrigel包被的Transwell小室的上室中，在下室加入600 μL含有10%FBS的完全培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)48、56 h(MDA-MB-231則分別培養(yǎng)12、14 h)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室用90%乙醇固定30 min，棄去乙醇，晾干后再使用結(jié)晶紫染色30 min。最后使用沾濕的棉棒將小室內(nèi)部細(xì)胞輕輕拭去，顯微鏡下拍照并保存。

2 結(jié)果

2.1 LINC00847-shRNA的干擾效率檢測(cè)采用qRT-PCR檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中LINC00847-shRNA的干擾效率。結(jié)果顯示，與對(duì)照組Plko.1組相比，shRNA-1組和shRNA-2組

LINC00847的水平顯著下調(diào)(P<0.001，圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)MCF-7(A)和MDA-MB-231(B)細(xì)胞中LINC00847的表達(dá)水平

2.2 沉默LINC00847對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響使用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)沉默LINC00847對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示，與Plko.1組相比，shRNA-1組和shRNA-2組的細(xì)胞增殖能力顯著下降(P<0.001，圖2)。

圖2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默LINC00847對(duì)MCF-7(A)和MDA-MB-231(B)細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 沉默LINC00847對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成能力的影響使用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)沉默LINC00847對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成能力的影響。結(jié)果顯示，與Plko.1組相比，shRNA-1組和shRNA-2組的細(xì)胞克隆形成能力顯著下降(P<0.001，圖3)。

圖3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默LINC00847對(duì)MCF-7(A)和MDA-MB-231(B)細(xì)胞克隆形成能力的影響

2.4 沉默LINC00847對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響使用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)沉默LINC00847對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，與Plko.1組相比，shRNA-1組和shRNA-2組的細(xì)胞遷移和侵襲能力均顯著下降(P<0.001，圖4)。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默LINC00847對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

3 討論

乳腺癌是全球女性患病率最高的惡性腫瘤，病死率位居女性惡性腫瘤的第2位[7]。目前乳腺癌治療主要原則是精準(zhǔn)化和綜合性治療，首選手術(shù)治療，術(shù)后輔以化療，同時(shí)聯(lián)合運(yùn)用內(nèi)分泌治療、靶向治療等，雖然這些治療方法在一定程度上提高了療效和患者的生活質(zhì)量，但是術(shù)后復(fù)發(fā)再治療依舊是亟待解決的難題[8-9]。近年來，發(fā)現(xiàn)與乳腺癌治療相關(guān)的生物標(biāo)志物越來越多。郭欠影等[10]發(fā)現(xiàn)ARHGDIB的高表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的阿霉素耐藥。魏瑜等[11]發(fā)現(xiàn)RUNX3能夠通過Wnt/β-catenin通路抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。即便如此，關(guān)于乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制仍未明了。因此，乳腺癌研究領(lǐng)域迫切需要對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)基因進(jìn)行更加系統(tǒng)、全面和深入的研究。

lncRNA是長(zhǎng)度大于200 nt，不具有編譯蛋白質(zhì)能力的一類RNA[12]。lncRNA可以通過多種方式行使調(diào)控功能，如順式或反式調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，與蛋白質(zhì)或RNA相互作用，影響核結(jié)構(gòu)域的組織等[13]。有多種lncRNA可以促進(jìn)癌癥的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥，并在許多人類癌癥中表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)，體現(xiàn)出它們潛在的臨床相關(guān)性[14]。許多l(xiāng)ncRNA的表達(dá)特征與乳腺癌患者預(yù)后、生存率和疾病復(fù)發(fā)有關(guān)，這些相關(guān)因素可以幫助完善疾病管理策略[15-16]。更重要的是，乳腺癌中的組織特異性lncRNA表達(dá)可以作為臨床上有用的生物標(biāo)志物來區(qū)分正常組織和腫瘤組織或乳腺癌亞型[17-20]。lncRNA作為乳腺癌的標(biāo)志物能夠促進(jìn)早期乳腺癌的診斷并且提高治療療效[18,20-25]。靶向lncRNA也可能拮抗癌癥的進(jìn)展，改善臨床前景[26]。LINC00847位于5號(hào)染色體長(zhǎng)臂，是一種新鑒定的lncRNA，在腎細(xì)胞癌、乳腺癌和肺癌等腫瘤中均有LINC00847的異常表達(dá)[5,27-28]。Li等[4]發(fā)現(xiàn)LINC00847可被E2F1誘導(dǎo)，上調(diào)的LINC00847通過調(diào)節(jié)miR-147a/IFITM1軸促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展。Tu等[6]發(fā)現(xiàn)LINC00847通過充當(dāng)miR-99a的海綿誘導(dǎo)E2F2表達(dá)從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展。但是，乳腺癌中異常表達(dá)的LINC00847的具體功能尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為探究LINC00847的表達(dá)對(duì)乳腺癌的影響，本實(shí)驗(yàn)選用經(jīng)典的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231構(gòu)建了shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)敲低細(xì)胞系，然后檢測(cè)細(xì)胞各種功能的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：沉默LINC00847的表達(dá)后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力、遷移以及侵襲能力均顯著下降。

綜上所述，沉默LINC00847的表達(dá)可抑制乳腺癌的增殖、遷移以及侵襲能力。由于LINC00847在乳腺癌中表達(dá)異常，推測(cè)LINC00847可能參與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程，并為乳腺癌的治療和診斷提供新思路，但LINC00847發(fā)揮功能的分子機(jī)制仍需深入探究。