甄 娟，劉玉東，宋春紅，吳 莎，焦瑞芬

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是發(fā)達(dá)國(guó)家婦科癌癥死亡的主要原因[1]。卵巢上皮性癌是最常見(jiàn)的病理類(lèi)型，占所有類(lèi)型卵巢癌的90%，由于卵巢位于盆腔內(nèi)，早期癥狀隱匿，早期診斷缺乏敏感性和特異性均較高的指標(biāo)，多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期，且卵巢癌極易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅著女性的健康和生命。卵巢癌患者標(biāo)準(zhǔn)治療方法是行腫瘤減滅術(shù)后接受鉑類(lèi)化療，盡管一線治療方案已取得較大進(jìn)展，多數(shù)患者仍會(huì)復(fù)發(fā)，并對(duì)鉑類(lèi)化療產(chǎn)生耐藥[2-3]。因此，提高卵巢癌早期檢出率和尋找有效的基因進(jìn)行靶向治療是提高卵巢癌患者生存率的最重要手段。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，MSI2是造血干細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子，在白血病和多種實(shí)體腫瘤中異常表達(dá)，且與腫瘤低分化狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者不良預(yù)后密切相關(guān)[4-8]。由此可見(jiàn)MSI2作為腫瘤促進(jìn)因子發(fā)揮生物學(xué)作用，并對(duì)臨床評(píng)估患者的預(yù)后具有重要意義。然而MSI2在卵巢癌中的相關(guān)研究較少，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化和Western blot法檢測(cè)MSI2在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，分析MSI2表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征及患者預(yù)后的相關(guān)性，尋找卵巢癌新的診斷、靶向治療和預(yù)后評(píng)估分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010年1月～2021年10月石家莊市第四醫(yī)院/河北醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院存檔的婦科手術(shù)切除標(biāo)本164例，其中卵巢癌75例，癌旁正常卵巢組織50例，輸卵管組織39例，所有患者術(shù)前均未接受藥物治療及放、化療。標(biāo)本石蠟包埋切片后經(jīng)HE染色后明確診斷，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO(2020)卵巢腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)和FIGO分期系統(tǒng)。根據(jù)病理特征和分子遺傳學(xué)改變確定腫瘤類(lèi)型(其中Ⅰ型卵巢癌36例和Ⅱ型卵巢癌39例)。術(shù)中同時(shí)留取同一患者的卵巢癌組織及癌旁正常卵巢組織和輸卵管組織，新鮮組織離體后取少量放入EP管立即凍存于液氮后，移入-80 ℃低溫冰箱保存，以備Western blot檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)了本院倫理委員會(huì)審核，且獲得患者知情同意。

1.2 主要試劑兔抗人MSI2單克隆抗體(ab76148)購(gòu)自Abcam公司，免疫組化SP試劑盒和DAB顯色劑均購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、脫水、透明、浸蠟、包埋，4 μm厚連續(xù)切片。操作過(guò)程嚴(yán)格按照免疫組化SP試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行MSI2(1 ∶400)染色。觀察MSI2在卵巢癌組織、癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織中的表達(dá)部位。判讀標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)主要表現(xiàn)為細(xì)胞核/質(zhì)/膜出現(xiàn)清晰的著色及達(dá)到一定數(shù)量陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(400×)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。(1)按細(xì)胞著色深淺評(píng)分：無(wú)細(xì)胞著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。(2)按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。將上述兩項(xiàng)評(píng)分相乘作為最終結(jié)果：≥3分為陽(yáng)性，<3分為陰性。

1.3.2Western blot法 將新鮮組織剪碎、裂解、再粉碎、勻漿、離心，提取上清液為總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度，取80 μg蛋白樣本進(jìn)行聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉2 h，MSI2與內(nèi)參β-actin一抗4 ℃孵育過(guò)夜，第2天洗膜后與相應(yīng)二抗37 ℃孵育2 h，發(fā)光，掃描圖像并分析各條帶的光密度值，以目的蛋白與β-actin光密度值比值作為相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3隨訪 對(duì)所有卵巢癌患者術(shù)后進(jìn)行定期隨訪，主要采用患者門(mén)診復(fù)查及電話隨訪等方式，平均每6個(gè)月隨訪1次，若隨訪期間出現(xiàn)患者死亡，規(guī)定其死亡時(shí)間為終止時(shí)間，亦納入生存分析。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織、癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織中MSI2蛋白的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，卵巢及輸卵管組織中MSI2的表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，部分位于細(xì)胞核(圖1)，其在卵巢癌中的陽(yáng)性率(73.33%，55/75)高于癌旁正常卵巢組織(16.00%，8/50)及輸卵管組織(12.82%，5/39)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=39.448，P<0.001；χ2=37.686，P<0.001)。MSI2表達(dá)與Ⅱ型卵巢癌、高FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P均<0.05，表1)。

表1 卵巢癌組織中MSI2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

圖1 MSI2在不同組織中的表達(dá)，SP法；A.漿液性癌中MSI2呈彌漫強(qiáng)陽(yáng)性；B.子宮內(nèi)膜樣癌中MSI2呈彌漫強(qiáng)陽(yáng)性；C.黏液性癌中MSI2呈彌漫強(qiáng)陽(yáng)性；D.透明細(xì)胞癌中MSI2呈彌漫強(qiáng)陽(yáng)性；E.癌旁正常卵巢組織中MSI2呈陰性；F.輸卵管組織中MSI2呈陰性

2.2 新鮮卵巢組織及輸卵管組織中MSI2的表達(dá)量Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，30例卵巢癌、30例癌旁正常卵巢組織和30例輸卵管組織中MSI2的相對(duì)表達(dá)量分別為1.14±0.19、0.38±0.06、0.33±0.08。卵巢癌中MSI2的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.702，P<0.001；t=21.271，P<0.001)(圖2)。

圖2 MSI2在卵巢癌組織、癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織中的表達(dá)：MSI2在卵巢癌組織(C1、C2)中的表達(dá)高于輸卵管組織(N1、N2)及癌旁正常卵巢組織(N3、N4)

2.3 MSI2表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系生存分析結(jié)果顯示，MSI2陽(yáng)性患者中位生存時(shí)間為(45.00±4.364)個(gè)月；MSI2陰性患者中位生存時(shí)間為(60.00±2.137)個(gè)月。MSI2陽(yáng)性患者生存時(shí)間及總生存率低于陰性患者(Log-rank檢驗(yàn)Waldχ2=8.620，P=0.003，表2)。單因素和多因素分析結(jié)果表明，MSI2蛋白表達(dá)、腫瘤分型、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者預(yù)后相關(guān)(P均<0.05，表2，圖3)，MSI2蛋白表達(dá)水平是卵巢癌患者不良預(yù)后的可選預(yù)測(cè)因素之一(P=0.031，表3)。

表2 卵巢癌患者總生存率的單因素分析

表3 卵巢癌患者總生存率的多因素分析

圖3 卵巢癌主要臨床病理因素與患者預(yù)后的關(guān)系：A.MSI2表達(dá)；B.FIGO分期；C.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；D.腫瘤分型

3 討論

MSI(musashi)蛋白家族是高度保守的RNA結(jié)合蛋白，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，MSI家族有MSI1和MSI2兩個(gè)成員，MSI1和MSI2蛋白在N端有兩個(gè)高度保守的RNA結(jié)合域(RNA banding domains, RBDS)，其序列同源性接近90%，在較不保守的C末端區(qū)，顯示了約70%的序列同源性。MSI2基因定位于人染色體17q22，包含328個(gè)氨基酸，其編碼蛋白MSI2具有2個(gè)剪接體形式(MSI2L和MSI2S)，相對(duì)分子質(zhì)量分別為36.9×103和35.7×103，MSI2通過(guò)RNA識(shí)別結(jié)構(gòu)序列(RNA recognition motif, RRM)直接識(shí)別并與RNA結(jié)合，進(jìn)而抑制翻譯過(guò)程，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖及造血干細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。最初研究發(fā)現(xiàn)，MSI2過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)白血病的發(fā)生、發(fā)展，隨后越來(lái)越多的研究結(jié)果證實(shí)MSI2在大部分實(shí)體腫瘤中過(guò)表達(dá)并在腫瘤的增殖、侵襲過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9-14]。

研究者利用BioExpress數(shù)據(jù)庫(kù)和MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)，分析人類(lèi)癌癥TCGA的基因表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)癌旁正常組織相比，許多人類(lèi)癌癥包括子宮頸癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和甲狀腺癌等組織中MSI2 mRNA表達(dá)增高。隨后在子宮頸癌中做了一系列表型實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MSI2過(guò)表達(dá)促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞集落形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和侵襲遷移，敲低MSI2的表達(dá)后，出現(xiàn)相反的結(jié)果[15]。Liu等[16]研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，與正常子宮頸組織相比，MSI2在子宮頸癌中的表達(dá)明顯增高，且與FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，MSI2陽(yáng)性患者總生存率和無(wú)進(jìn)展生存率明顯下降，Cox回歸分析結(jié)果表明，MSI2是子宮頸癌總生存期和無(wú)瘤生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。Fang等[17]的研究結(jié)果表明，MSI2在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，過(guò)表達(dá)MSI2后，腫瘤細(xì)胞集落形成和存活率明顯增加，腫瘤細(xì)胞凋亡下降，Ki-67表達(dá)增高，此外，敲低MSI2表達(dá)后，細(xì)胞對(duì)索拉非尼敏感性增加，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞存活率和集落形成數(shù)量減少，凋亡升高，Ki-67表達(dá)下降。說(shuō)明MSI2過(guò)表達(dá)或敲低改變了腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)、自我更新以及肝癌細(xì)胞系對(duì)化療的抵抗性，在小鼠異種移植模型中，過(guò)表達(dá)MSI2能顯著增加腫瘤的體積和質(zhì)量。同時(shí)MSI2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致lin28a水平上調(diào)，MSI2和lin28a水平與肝癌患者的臨床嚴(yán)重程度和預(yù)后呈正相關(guān)。Zhao等[18]研究發(fā)現(xiàn)MSI2在前列腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，并且與腫瘤分級(jí)呈相關(guān)性。MSI2在雄激素敏感和不敏感前列腺癌細(xì)胞中的下調(diào)均能抑制體內(nèi)腫瘤的形成和體外細(xì)胞生長(zhǎng)，敲低MSI2后腫瘤細(xì)胞集落形成減少，增殖能力下降，移植鼠腫瘤生成速率和生長(zhǎng)速度均減慢，推測(cè)MSI2在腫瘤形成和生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，過(guò)表達(dá)的AR能夠扭轉(zhuǎn)MSI2敲除后的腫瘤抑制作用，MSI2與AR呈密切正相關(guān)。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中MSI2高表達(dá)，MSI2基因沉默或過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖有明顯影響。在異種移植模型中，MSI2表達(dá)沉默可明顯抑制O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)的表達(dá)和腫瘤生長(zhǎng)，并逆轉(zhuǎn)替莫唑胺的耐藥性[19]。在結(jié)腸癌、膽管癌和食管癌中的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，MSI2高表達(dá)與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為有關(guān)。MSI2高表達(dá)患者的總生存率和無(wú)瘤生存期縮短，并且其是總生存率和無(wú)瘤生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[20-22]。由此可見(jiàn)，MSI2作為腫瘤促進(jìn)因子在多種惡性腫瘤的發(fā)生及惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，且與患者不良預(yù)后相關(guān)。在卵巢癌中MSI2是否也發(fā)揮同樣的促癌作用呢？本組Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果示，MSI2在卵巢癌組織中的蛋白表達(dá)量高于癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織。與之一致的是，免疫組化結(jié)果亦顯示，在卵巢癌組織中MSI2的陽(yáng)性率高于癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，MSI2表達(dá)與Ⅱ型卵巢癌、高FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，由此推測(cè)MSI2可能作為癌基因在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步結(jié)合患者的臨床資料進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的MSI2、Ⅱ型卵巢癌、高FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者總生存率下降，生存期縮短，Cox多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，MSI2的蛋白表達(dá)水平是卵巢癌患者不良預(yù)后的可選預(yù)測(cè)因素之一。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MSI2作為促瘤因子在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后評(píng)估過(guò)程中發(fā)揮重要作用。推測(cè)MSI2具有成為卵巢癌診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛在可能，同時(shí)為臨床評(píng)估患者的預(yù)后提供理論依據(jù)，然而本實(shí)驗(yàn)只是初步驗(yàn)證，其在卵巢癌中的具體機(jī)制有待積累大樣本進(jìn)行深入探究。