曹曉東 ，張 楠 ，張子英 ，劉 穎 ，杜 華 ，韓 帥

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)GLP中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

機(jī)體的免疫系統(tǒng)是維持機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)、抵御外界刺激的重要保證，近20年來(lái)自身免疫性疾病和過(guò)敏性疾病的發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)[1]。使用中藥來(lái)增強(qiáng)免疫力，具有副作用小、來(lái)源廣泛的優(yōu)勢(shì)。以中藥養(yǎng)生和中醫(yī)體質(zhì)辨識(shí)為基礎(chǔ)，對(duì)中藥中免疫功能活性物質(zhì)進(jìn)行研發(fā)已經(jīng)成為中藥研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。Matrine的來(lái)源非常廣泛，可從大多數(shù)豆科植物中提取，含量最為豐富的是苦參和苦豆子等植物，其藥理作用主要包括抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、鎮(zhèn)痛、平喘、抗肝纖維化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等[2]。Matrine對(duì)小鼠的免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，但matrine調(diào)節(jié)免疫功能的效應(yīng)復(fù)雜，系統(tǒng)地研究matrine對(duì)免疫功能低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用不僅有利于將matrine作為免疫調(diào)節(jié)藥物拓寬研發(fā)探索途徑，還可以為全面了解matrine的免疫調(diào)節(jié)作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。SPF級(jí)昆明小鼠60只，體重為18～22 g，雌雄各半，購(gòu)買(mǎi)自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 (生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-2020-0001；批準(zhǔn)號(hào)：京動(dòng)字 8910M047)，自由飲食，飼養(yǎng)環(huán)境符合GB-14925-2010實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施要求，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，采用分層分組法進(jìn)行分組，分為空白對(duì)照組（CON）、免疫功能低下組(環(huán)磷酰胺)、左旋咪唑(levamisole)陽(yáng)性對(duì)照組，以及matrine高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組10只。

1.1.2 試劑與儀器。matrine（批號(hào)：20200912，Solarbio公司），MTT 試劑（Sigma 公司），胎牛血清（Gibco 公司），胰酶-EDTA消化液（Hyclone公司）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning 公司），CO2培養(yǎng)箱（美國(guó) Thermo 公司）；倒置熒光顯微鏡 （Olympus），環(huán)磷酰胺（cyclophos phamide，CTX）(Sigma 公司)，刀豆蛋白（concanavalin A，Con A） (Sigma公司)，左旋咪唑(levamisole)，二硝基氯苯丙酮，印度墨汁（phygene biotechnology），2%綿羊紅細(xì)胞 （北京博爾西科技有限公司），都氏試劑，10%豚鼠補(bǔ)體，小鼠脾淋巴細(xì)胞分離液試劑盒（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

免疫功能低下組(環(huán)磷酰胺)、matrine高劑量組、中劑量組和低劑量組，4組用于制備免疫力低下的小鼠模型，于試驗(yàn)第1天腹腔注射150 mg/kg劑量的環(huán)磷酰胺；第2天環(huán)磷酰胺劑量為80 mg/kg，第3天與第2天注射劑量相同?？瞻讓?duì)照組 （CON）、左旋咪唑(levamisole)陽(yáng)性對(duì)照組腹腔分別注射相同體積的生理鹽水。之后，matrine高、中、低劑量組腹腔注射matrine，高劑量組為160 mg/kg，中劑量組為80 mg/kg，低劑量組為40 mg/kg。連續(xù)給藥7 d，對(duì)照組和左旋咪唑組腹腔分別注射相同體積的生理鹽水和40 mg/kg體重的左旋咪唑。

給藥第7天進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)耳郭腫脹度檢測(cè)（DTH）和碳廓清試驗(yàn)，之后對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射2%致敏紅細(xì)胞(SRBC)0.2 mL/只。連續(xù)注射3 d，之后再過(guò)5 d（即給藥后第15 d）對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶后靜脈叢取血和血清溶血素含量的測(cè)定。小鼠CO2安樂(lè)死，進(jìn)行腹腔巨噬細(xì)胞增殖試驗(yàn)，脾/胸腺指數(shù)測(cè)定，并且制備細(xì)胞懸液完成脾淋巴/胸腺細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)由IBM SPSS statistics 21軟件進(jìn)行分析，分析方法為單因素方差分析法，方差齊性檢驗(yàn)則用LSD法；方差不齊使用Dunnett T3法檢測(cè)，計(jì)量資料均以x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 matrine對(duì)免疫低下小鼠脾/胸腺指數(shù)的影響

圖1結(jié)果顯示，同空白對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺可以提高脾臟指數(shù)、降低胸腺指數(shù)，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而 matrine 高、中、低 3 個(gè)劑量組均可增加免疫低下小鼠脾/胸腺指數(shù)，但是結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 matrine對(duì)免疫低下小鼠模型脾/胸腺指數(shù)的影響

2.2 matrine對(duì)免疫低下小鼠模型細(xì)胞免疫的影響

圖2A結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠的耳腫脹度影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。左旋咪唑組可以顯著增加免疫低下小鼠的耳腫脹度（P＜0.05）； 高劑量的 matrine 能顯著增加免疫低下小鼠的耳腫脹度（P＜0.05），中低劑量組雖有影響，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖2B、2C結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺能降低小鼠的脾淋巴細(xì)胞 （P＜0.05），但matrine高、中、低3個(gè)劑量組均對(duì)免疫低下模型小鼠的脾轉(zhuǎn)化率影響不明顯（P＞0.05）；matrine高、中、低 3 個(gè)劑量組均能顯著增加免疫低下小鼠的胸腺指數(shù)（P＜0.01）。

圖2 matrine對(duì)免疫低下小鼠模型T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的影響

2.3 matrine對(duì)免疫低下小鼠抗體形成細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）的影響

圖3結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，左旋咪唑組能降低HC50，但不顯著；matrine和環(huán)磷酰胺組均未對(duì)免疫低下小鼠的HC50產(chǎn)生影響，與空白對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖3 matrine對(duì)免疫低下小鼠模型體液免疫的影響

2.4 matrine對(duì)免疫低下非特異性免疫功能的影響

圖4B結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，左旋咪唑組能極顯著增加免疫低下小鼠的碳廓清能力（P＜0.01），同時(shí)matrine中劑量組增加效果顯著（P＜0.05），低劑量組增加效果極顯著（P＜0.01）；圖4A結(jié)果顯示，左旋咪唑組能極顯著增加免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖能力（P＜0.01），與空白對(duì)照組相比，matrine高、中劑量組腹腔巨噬細(xì)胞的增殖能力增加效果均顯著（P＜0.05）。

圖4 matrine對(duì)免疫低下小鼠模型非特異性免疫功能的影響

3 討論

近年來(lái)，中藥對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能的研究日益重要。合理地開(kāi)發(fā)利用中藥藥材資源，提高動(dòng)物機(jī)體免疫力，具有多重經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值[4-5]。Matrine能顯著抑制正常小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能；抑制血清溶菌酶活力、抗體形成細(xì)胞的產(chǎn)生和血清溶血素的生成[6]。機(jī)體免疫功能表現(xiàn)亢進(jìn)時(shí)，脾臟細(xì)胞也相應(yīng)地增殖[7]。Matrine一方面可以顯著降低免疫功能正常的T淋巴細(xì)胞功能，另一方面又可以增加免疫抑制組的T淋巴細(xì)胞免疫功能。這體現(xiàn)出matrine對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的雙向性。盡管有關(guān)于matrine對(duì)于健康小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫等方面的免疫調(diào)節(jié)作用研究，但沒(méi)有建立免疫低下小鼠模型，并不能反映matrine對(duì)免疫功能狀態(tài)低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)主要從免疫器官、細(xì)胞免疫和體液免疫幾個(gè)方面，探究了matrine對(duì)免疫低下小鼠模型的影響，從而明確matrine對(duì)免疫功能低下小鼠模型的免疫調(diào)節(jié)作用。

本研究中環(huán)磷酰胺能提高胸腺指數(shù)降低脾指數(shù)、抑制小鼠脾/胸腺淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，降低耳腫脹度，說(shuō)明成功地建立了免疫低下小鼠模型。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，免疫增強(qiáng)劑左旋咪唑和matrine組均能增加胸腺淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，但二者均不能完全逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺抑制的胸腺淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況。

T淋巴細(xì)胞的功能狀態(tài)在很大程度上能反映出機(jī)體的細(xì)胞免疫水平[8-9]。左旋咪唑和matrine均能顯著增加免疫低下小鼠耳腫脹度，說(shuō)明matrine能增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。鑒于免疫細(xì)胞的數(shù)量和刺激劑的不同，免疫細(xì)胞在調(diào)控機(jī)體的免疫功能方面具有重要的作用。而matrine作為免疫抑制藥物在臨床中多用于治療病毒性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等疾病[10]，有必要探討不同劑量的matrine對(duì)免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的試驗(yàn)和免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響，研究matrine的免疫調(diào)控作用。

Matrine和左旋咪唑組均未對(duì)環(huán)磷酰胺抑制的HC50產(chǎn)生影響，說(shuō)明matrine未對(duì)免疫低下小鼠產(chǎn)生體液免疫調(diào)節(jié)作用。matrine和左旋咪唑均能顯著增加免疫低下小鼠的碳廓清能力，說(shuō)明matrine可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，matrine和左旋咪唑可提高機(jī)體的非特異性免疫功能。

有文獻(xiàn)報(bào)道，matrine注射液輔助宮頸癌化療的增敏效果顯著，能有效降低患者CA125及IL-6水平，顯著改善機(jī)體T細(xì)胞免疫功能[11]；協(xié)同環(huán)孢素顯著延長(zhǎng)小鼠異體移植皮膚存活時(shí)間[12]；降低骨髓移植（即異基因造血干細(xì)胞移植）小鼠的血清干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)水平，產(chǎn)生免疫抑制作用。Matrine能上調(diào)干擾素-γ和下調(diào)白介素水平，還可以抑制支氣管哮喘的炎癥反應(yīng)[13]。上述疾病均為自身免疫疾病模型，由此可見(jiàn)matrine改善了上述疾病的進(jìn)程，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。

總之，matrine能增強(qiáng)免疫低下小鼠的細(xì)胞免疫功能和非特異性免疫功能，本試驗(yàn)系統(tǒng)地研究了matrine對(duì)免疫低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，為臨床開(kāi)發(fā)和利用matrine提供免疫藥理學(xué)研究基礎(chǔ)。