唐 飛，閆洪玲，楊 麗，孫家宜，胡昌江,，彭 成，敖 慧*，譚玉柱*

1成都中醫(yī)藥大學藥學院 西南特色中藥資源國家重點實驗室；2成都中醫(yī)藥大學藥學院 中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，成都 611137；3四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司 國家中醫(yī)藥管理局“中藥配方顆粒質量與療效評”重點研究室，彭州 611930

川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，為著名的川產道地藥材，具有活血祛瘀、行氣解郁、祛風止痛的功效，臨床用于治療頭痛、肝郁氣滯證以及多種淤血證[1]。然其傳統(tǒng)藥用部位為干燥根莖，而占全株鮮重的75%的地上部位(莖葉)多廢棄，不僅造成資源浪費和環(huán)境污染，且不利于中藥資源的可持續(xù)利用。川芎莖葉古稱蘼蕪，《神農本草經》記載“主咳逆、定驚氣、辟邪惡、除蠱毒、鬼痊、去三蟲、久服通神”，在川芎主產區(qū)四川都江堰、彭州一帶都有民間食用川芎嫩葉的習慣，以預防心腦血管疾病。其中，苯酞類化合物作為川芎的主要活性成分，對心腦血管和神經系統(tǒng)等具有明顯調節(jié)作用，有研究推測其為川芎治療瘀血證或是心腦血管疾病的主要物質基礎[2]。而血管擴張是目前用于冠心病、心絞痛以及心肌梗死等心血管疾病的主要治療方式，已有研究表明藁本內酯，洋川芎內酯A具有舒張血管活性[2]。因此，考察苯酞類成分的血管舒張活性對明確川芎及其地上部位的功效應用都具有重要意義。

課題組前期從川芎莖葉中首次發(fā)現了能舒張血管的苯酞類成分[2]，本文在前期研究基礎上，進一步挖掘其中的苯酞類成分，研究其血管舒張作用及其初步機制，并探討了構效關系。本文進一步豐富了川芎莖葉苯酞類成分庫，初步探討了苯酞類成分血管舒張作用的構效關系，為川芎及其地上部位的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Avance 400 MHz超導核磁共振儀，Avance 600 MHz超導核磁共振儀(德國Bruker公司)；Synapt G2 HDMS質譜儀(Waters公司)；X-ray(APEX-IICCD,Bruker SMART公司)；Perkin-Elmer 341 plus旋光測定儀(美國Perkin Elmer公司)；LC50型中高壓制備液相(賽譜銳思北京科技有限公司)；色譜柱(COSMOS，Choiester，10ID×250 nm，5 μm；CHIRALPAKIC(LotNO.IC00CE-XC014)column(250 mm×4.6 mm，5 μm))；FA2004B電子天平(上海越平科學儀器有限公司)；離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)(PL3508B6/C-V Panlab 8 Chamber Organ Bath System)；凈化工作臺(SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術有限公司)；細胞培養(yǎng)箱(15AC,SANYO公司)；高速低溫離心機(Biofuge 28RS，Heraeus Sepa Tech公司)；顯微鏡(IX71/AE31EF INV,Olympus(Japan)/Motic(China))；優(yōu)普UPT系列超純水(成都優(yōu)普電子產品有限公司)；可調式移液器(Thermo Fisher Scinentific)。

Sephadex LH-20色譜填料(瑞士Pharmacia公司)；MCI樹脂(日本三菱化學公司)；硅膠GF254薄層板、200～300目柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)；色譜純甲醇、正己烷、異丙醇(美國TEDIA公司)；氘代試劑(美國CIL公司)。其他試劑為分析純(成都市科隆化學品有限公司)；硝苯地平(Nifedipine，NF，美國SIGMA公司)。Fluo-3AM(10μg，索萊寶)；激光共聚焦顯微成像系統(tǒng)(Olympus，Tokyo，Japan)；胎牛血清(10099-141500ml，GIBCO公司)。

SD大鼠，SPF級，雌雄均可，體質量200～240 g，由四川成都達碩生物科技有限公司提供，許可證號SCXK(川)2015-030。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，晝夜光照及通風環(huán)境自然調節(jié)。A10大鼠平滑肌細胞購自北京愛思益普生物科技股份有限公司。

川芎莖葉于2018年4月采自四川省眉山市東坡區(qū)，經成都中醫(yī)藥大學胡昌江教授鑒定為川芎L.chuanxiong的莖葉，標本CX20180402現存于成都中醫(yī)藥大學中藥化學1001研究室。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離

取自然陰干的川芎莖葉(20 kg)粉碎成粗粉，用95%乙醇滲漉提取，減壓濃縮成浸膏。采用系統(tǒng)溶劑法萃取得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部位。取石油醚部位(0.5 kg)過MCI色譜柱(90%甲醇/水，V/V)脫色素處理，濃縮液過硅膠柱(200～300目)，石油醚/乙酸乙酯(99∶1→1∶99，V/V)梯度洗脫，分別得到組分A～F。C組分用硅膠柱(正己烷/丙酮99∶1→1∶99，V/V)梯度洗脫，得C1～C6。C3經HPLC(75%甲醇/水，2 mL/min，V/V)制備得到化合物3(5 mg，tR=17.5 min)。C1經HPLC(60%甲醇/水，2 mL/min，V/V)制備得到化合物12(6 mg，tR=6.78 min)、13(6 mg，tR=8.28 min)。D組分用正己烷/丙酮(80∶1→1∶99，V/V)梯度洗脫，得D1～D4。D3經HPLC(甲醇/水70%→99%，2 mL/min，V/V)粗化段得D3.1～D3.4。D3.2經HPLC(65%甲醇/水，2 mL/min，V/V)制備得到化合物4(6 mg，tR=8.26 min)、6(5 mg，tR=11.18 min)，D3.3經HPLC(70%甲醇/水，2 mL/min，V/V)，制備薄層板(石油醚/乙酸乙酯2∶1)制備得到化合物8(4 mg)。D4經HPLC(甲醇/水70%→99%，3 mL/min，V/V)得化合物1(5 mg，tR=28.22 min)，15(3.2 mg，tR=32.24 min)。E經凝膠色譜柱(二氯甲烷/甲醇4∶6)，得E1～E5。E4經HPLC(70%甲醇水，3 mL/min)制備得到化合物5(4 mg，tR=10.02)、9(4 mg，tR=18.46)。E5經HPLC(70%甲醇/水，3 mL/min)制備得到化合物7(9 mg，tR=14.28 min)。F組分用正己烷/丙酮(99∶1→1∶99，V/V)梯度洗脫，得F1～F8，F3經中壓C18柱(甲醇/水70%→99%，8 mL/min，V/V)梯度洗脫，得F3.1～F3.3。F3.2～F3.3經HPLC(70%甲醇/水，2 mL/min，V/V)分別制備得到化合物10(6 mg，tR=28.64 min)、11(5 mg，tR=32.48 min)；F7、F8經HPLC(65%甲醇/水，2 mL/min，V/V)制備得到化合物14(4 mg，tR=13.26 min)，2(4 mg，tR=18.66 min)?；衔?采用手性柱(Lot NO.IC00CE-XC014；4.6 μm，250 mm×4.6 mm)進一步分離(208 nm，正己烷/異丙醇(90∶10)，0.8 mL/min，V/V)，得到1a和1b。

1.2.2 血管舒張實驗

大鼠頸椎脫臼處死打開胸腔取出胸主動脈，剪成約4 mm長的血管環(huán)置于O2飽和的4 ℃K-H液(NaCl 6.92，KCl 0.35，CaCl20.28，KH2PO40.16，MgSO40.14，NaHCO32.00,Glucose 1.82，EDTA 0.009 g/L)，37 ℃恒溫。連接離體組織灌流模型和Power Lab數據分析系統(tǒng)，調節(jié)靜息張力為1 g，持續(xù)通入94.6%O2+5.4%CO2的混合氣體，每隔15 min更換K-H液，重復2次，平衡60 min后，用KCl(60 mM)刺激血管環(huán)，張力達坪值用K-H液沖洗3次，每次間隔5 min，恢復到基礎狀態(tài)后，穩(wěn)定30 min，重復刺激2次。待第3次預收縮血管環(huán)達坪值并穩(wěn)定后，浴槽內累積加入2.4～12 μM樣品，體積共2 μL，空白組加入等體積DMSO[2]。以硝苯地平(NF)作為陽性藥對照，記錄受試化合物對血管的舒張效應曲線。

1.2.3 化合物15對A10血管平滑肌細胞內鈣離子濃度的影響

使用 Fluo-3 AM(5 μM)熒光探針為Ca2+指示劑，激光共聚焦顯微鏡測量[Ca2+]c的變化。將A10大鼠血管平滑肌細胞以1×105/mL的密度接種到直徑為20 mm的共聚焦小皿中，接種體積為1 mL，細胞搖勻后置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用無鈣HBSS液清洗3次，每次在培養(yǎng)箱中孵育5 min，吸走上清液之前輕輕搖晃共聚焦小皿，以確保皿中殘留的胎牛血清被完全洗掉。清洗結束后向小皿中加入1 mL含鈣HBSS液，加入100 mM KCl造模，同時給與化合物15(20 μM)，孵育30 min。孵育結束后，棄去皿中液體，用無鈣HBSS液清洗3次，每次在培養(yǎng)箱中孵育5 min，吸走上清液之前輕輕搖晃共聚焦小皿，以確保皿中殘留的含鈣HBSS液被洗去。向小皿中加入0.5 mL含有5 μM fluo-3/AM熒光探針的無鈣HBSS孵育細胞，孵育條件為恒溫37 ℃，避光孵育20 min，取出加入2.5 mL的無鈣HBSS液(含1%血清)，再孵育40 min。孵育結束后，棄去皿中液體，用無鈣HBSS液清洗3次，每次在培養(yǎng)箱中孵育5 min，吸走上清液之前輕輕搖晃共聚焦小皿，以確保皿中殘留的染料被洗去。上機檢測，記錄初始熒光濃度，對于每個細胞，[Ca2+]c從細胞區(qū)域內的像素平均。在分析之前進行背景扣除，計算給藥組和對照組的平均細胞熒光值[3,4]。

1.2.4 統(tǒng)計方法

以KCl(60 mM)所致的最大收縮張力為100%，按照公式計算各濃度化合物對血管收縮幅度的影響。實驗數據采用血管張力值變化反映藥物作用，單位為g。采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析處理，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

血管舒張率=[(最大收縮張力-

當前收縮張力)/最大收縮張力]×100%

2 結果

2.1 結構鑒定

圖1 化合物1～15結構Fig.1 The structures of compounds 1-15

分子式：C24H26O4，M = 378.45，晶胞參數為a= 9.008 4(5)?，b= 9.628 4(6)?，c= 13.206 4(7)?，α= 94.233(5)°，β= 109.374(5)°，γ= 100.971(5)°，V= 1 049.20(11)?3，T= 293K，空間群為P1，Z= 2，μ(MoKα) = 0.710 73 mm-1，收集衍射點數為8 610，獨立衍射點數為4 276(Rin t= 0.015 9)，R1= 0.062 5(I>2σ(I))，wR(F2) = 0.150 4(I>2σ(I))，R1= 0.108 3(all data)，wR(F2)= 0.180 4(all data)，F2= 1.023。其晶體數據已上傳于劍橋晶體數據中心，編號為CCDC2011219(立體結構見圖2)。

分子式：C24H32O4，M =384.49，晶胞參數為a=19.710(5)?，b=10.730(3)?，c=10.284(3)?，α= 90°，β= 90°，γ= 90°，V= 2 174.8(10)?3，T= 293 K，空間群為P212121，Z= 4，μ(MoKα) = 0.710 73 mm-1，收集衍射點數為6 758，獨立衍射點數為4 009(Rint= 0.081 2)，R1= 0.280 1(I>2σ(I))，wR(F2)=0.285 0(I>2σ(I))，R1=0.280 1(all data)，wR(F2)= 0.399 1(all data)，F2= 0.991，Flack參數為-4.2(10)，其晶體數據已上傳于劍橋晶體數據中心，編號為CCDC2011222。

圖2 化合物1、2單晶X射線衍射分析的分子立體結構Fig.2 Molecular 3D structure of compound 1 and 2 established by single crystal X-ray diffraction analysis

2.2 舒張血管活性及構效分析

空白組對氯化鉀(KCl)誘導的大鼠胸主動脈環(huán)收縮無明顯影響(P>0.05)，硝苯地平(NF)各濃度均能顯著舒張血管環(huán)(P<0.001)，最高濃度舒張率為118%(4 μM)。單苯酞化合物3、5、4、7、8、12、13最高濃度(12 μM)舒張率分別為42%、18%、51%、43%、44%、16%、33%(P<0.01)，苯酞二聚體化合物1、2、9、10、15最高濃度舒張率分別為65.6%、25%、17%、73%、93%(P<0.01)，化合物1、10、15的EC50分別為8.81、8.23、6.2 μM，結果見圖3a。此外，化合物1拆分后，1a、1b最高濃度舒張率分別為52.2%、46.5%；1a的EC50為11.83 μM，見圖3b。

構效分析表明，苯酞二聚體活性顯著優(yōu)于單苯酞(如化合物1、10、15)；羥基的取代位置不同對Z-丁烯基苯酞的活性影響顯著(如化合物4、5、6)；而C-6/C-7位取代與否對藁本內酯活性影響較小(如化合物3、7、8)；但當羥基取代于側鏈，尤其位于端基時對活性影響最大(如化合物12、13)；化合物1活性消旋體>左旋體>右旋體。

2.3 化合物15降低A10血管平滑肌細胞內鈣離子濃度

為了進一步探究其機制，選取血管舒張活性最優(yōu)的化合物15，探究其對大鼠血管平滑肌細胞鈣離子濃度影響。結果表明，化合物15在測試濃度下(20 μM)能顯著降低A10血管平滑肌細胞的熒光值(P<0.001)(見圖4)。其中，對照組熒光值為148，給藥組的熒光值為18。

3 討論與結論

據不完全統(tǒng)計，我國心血管疾病患者已達到2.9億人，居全球首位。目前治療心血管疾病的主要手段是藥物治療，比如血管擴張劑。通過促使血管擴張，改善血流動力效應，不僅可用于高血壓的治療，同時也是治療心腦血管疾病的重要手段。血腦屏障是影響腦血管疾病治療的主要因素，有研究表明苯酞類藥物可透過血腦屏障[17,18]，這可能是川芎“上行頭目”尤善于治療頭痛的藥效物質基礎。已有研究表明，洋川芎內酯A，藁本內酯能夠舒張KCl引起的血管收縮(pD24.42、4.43)[19,20]，且無內皮依賴性。藁本內酯作為其主要苯酞類成分，由于其不穩(wěn)定限制了其進一步應用。因此，其衍生物也應受到更多的關注[21,22]。

圖3 受試化合物的血管舒張率Fig.3 Vasodilation rate of test

圖4 A10平滑肌細胞熒光值Fig.4 The fluorescence of A10 smooth muscle 注：與對照組相比，***P<0.001。Note:Compared with control group,***P<0.001.

本實驗從川芎莖葉石油醚部位分離出15個苯酞類化合物，包括9個單苯酞，6個苯酞二聚體。其中，當歸內酯A(1)、新二聚藁本內酯(15)、茶芎內酯D(2)、Z-6-羥基-7-甲氧基-藁本內酯(8)、(3S，3aR)-3-羥乙基-3a，4，5，6-四氫苯酞(12)、(3S，3aR，10R)-(-)-10-羥基苯酞(13)為首次從川芎中分離；并首次對化合物1、2進行了單晶衍射，進一步確定其結構。本文簡要分析了羥基取代、旋光異構對苯酞血管舒張作用的影響，為下一步繼續(xù)豐富苯酞結構類型，深入研究構效關系提供參考，也為尋找新穎血管舒張劑先導化合物提供了方向。前期機制研究發(fā)現，藁本內酯的活性與抑制電壓依賴性鈣通道(VDCC)和受體操作鈣通道(ROCC)介導的Ca2+內流和釋放有關，并推測其可能與L型電壓門控鈣通道Cav1.2靶點有關[19,20]。本文通過激光共聚焦實驗，初步驗證了苯酞類成分血管舒張作用可能是通過影響離子通道開放抑制鈣離子內流引起，但是具體機制還有待進一步研究。通過對川芎地上生物資源的化學成分研究，進一步豐富了川芎莖葉的化學成分庫，為擴血管苗頭化合物發(fā)現奠定基礎，為民間食用川芎嫩葉預防心腦血管疾病提供科學依據。

致謝：感謝四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司的馮健、龐家鵝、賈麗娟、張莎莎等人在樣品采收前處理及耗材采購中提供的幫助，在此致謝！