王 領(lǐng)，董銀卯，張守文*

1國(guó)家藥品監(jiān)督管理局高級(jí)研修學(xué)院，北京100073；2北京工商大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，北京100048

常見(jiàn)的皮膚過(guò)敏反應(yīng)在醫(yī)學(xué)上稱作超敏反應(yīng)，又稱變態(tài)反應(yīng)，是指機(jī)體受到某些抗原刺激時(shí)，出現(xiàn)以生理功能紊亂或組織細(xì)胞損傷為主的異常特異性免疫應(yīng)答。其發(fā)生取決于兩個(gè)因素：抗原的刺激和機(jī)體的反應(yīng)性，誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的抗原稱為過(guò)敏原[1]。皮膚產(chǎn)生過(guò)敏時(shí)會(huì)出現(xiàn)皮膚干燥、疼痛、瘙癢現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)更可能伴有紅腫、皰疹等癥狀，給人們的日常生活帶來(lái)了很大影響。因此，舒敏類化妝品研發(fā)成為該領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一[2]。

2020年頒布的《化妝品監(jiān)督管理?xiàng)l例》中提出：“國(guó)家鼓勵(lì)和支持化妝品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者采用先進(jìn)技術(shù)和先進(jìn)管理規(guī)范，提高化妝品質(zhì)量安全水平；鼓勵(lì)和支持運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，結(jié)合我國(guó)傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)項(xiàng)目和特色植物資源研究開(kāi)發(fā)化妝品”。這也是政府首次從法律層面提出利用特色植物資源研究開(kāi)發(fā)化妝品，這將大大促進(jìn)植物資源化妝品的研發(fā)和創(chuàng)新。

本文在前期單味中藥篩選的研究基礎(chǔ)上，將六味中藥運(yùn)用中醫(yī)“君臣佐使”思想進(jìn)行組方，具有抗病原微生物、消炎、解熱、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫等作用[3]的香薷和具有清熱解毒功效[4]的山慈菇為“君藥”，起到抗敏、消腫止癢之功效；具有抗炎、鎮(zhèn)靜等藥理活性的獨(dú)活[5]為“臣藥”，起到抗炎殺菌之功效；可消腫止痛[6]的三棱和對(duì)皮膚無(wú)刺激性、抗氧化[7]，具有抗病原微生物藥理活性[8]的孩兒茶為“佐藥”，起到行氣止痛、快速修復(fù)皮膚之功效；遠(yuǎn)志為“使藥”，起到調(diào)和藥性，提高皮膚屏障之功效。繼續(xù)研究組方提取制備工藝，驗(yàn)證組方提取物舒敏功效，并探究其作用機(jī)理，以期為其在醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，該組方提取物現(xiàn)已授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利(專利號(hào)ZL202010224890.X)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用六味中草藥經(jīng)原山東宏濟(jì)堂中藥研究院副院長(zhǎng)、范圣此研究員基源鑒定，分別為香薷(Elsholtziaciliata(Thunb.) Hyland.干燥全株)、山慈菇(獨(dú)蒜蘭Pleionebulbocodioides(Franch.) Rolfe.干燥假鱗莖)、獨(dú)活(重齒毛當(dāng)歸Angelicabiserrata(Shan et Yuan) Yuan et Shan干燥根)、三棱(黑三棱SparganiumstolonierumBuch.-Ham.干燥塊莖)、孩兒茶(Acaciacatechu(L.f.) Willd.干燥去皮枝)、遠(yuǎn)志(PolygalatenuifoliaWilld.干燥根)。

透明質(zhì)酸酶(Sigma，貨號(hào)：H3884)；透明漢生膠(Maya，貨號(hào)：NZJ-132)；1,3-丁二醇(Aladdin，貨號(hào)：B111018)；EDTA-2Na(Clariant，批號(hào)：12101528)；透明質(zhì)酸鈉(華熙生物，批號(hào)：20022543)；海藻糖(Hayashibara，批號(hào)：12091330)；合成角鯊?fù)?西安康諾化工有限公司，批號(hào)200312A)；棕櫚酸乙基己酯(Basf，批號(hào)：19040153)；辛酸/癸酸甘油三酯(Croda，批號(hào)：mct600421)；辛酰羥肟酸、1,2-乙二醇、1,3-丙二醇(廣州華良化工有限公司，批號(hào)：191125-32)；硬脂酸甘油酯/PEG-100硬脂酸酯(昆山晟安生物科技有限公司，批號(hào)：19060855)；甘油葡糖苷(湖北漢達(dá)飛生物科技有限公司，批號(hào)：1207698)；甘草酸二鉀(億利耐雀生物科技有限公司，批號(hào)：18020201)；六味中藥材(北京同仁堂)；組方提取物(自制)、去離子水(自制)等。

1.2 儀器

AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；HH-S6/ZK6電熱恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；T18 digital剪切分散機(jī)、EUROSTAR 200 digital懸臂攪拌機(jī)(德國(guó)IKA公司)；VISIA面部圖像分析儀(美國(guó)Canfield公司)；Cutometer MPA 580(Tewameter TM300、Corneometer CM825、Mexameter MX18、Skin-pH meter pH905)(德國(guó)Courage + Khazaka公司)；N4S 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)；8 mm(20 μL)聚丙烯涂層(PP Coated)斑試器(上海攬寶公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 中藥組方提取物制備

按質(zhì)量比稱取中藥，香薷∶山慈菇∶獨(dú)活∶三棱∶孩兒茶∶遠(yuǎn)志=6∶5∶2∶2∶1∶1，6味中藥共100 g，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，取粒度為40～100 目的中藥顆粒50 g，加入15倍70%乙醇，60 ℃回流提取150 min；提取完成后將混合物冷卻至35 ℃，過(guò)濾除去濾渣，濾液稱重后，加入0.8%～1%的活性炭脫色，55～60 ℃脫色60～80 min，過(guò)濾除去活性炭，取濾液備用；將濾液在0.08 Mpa，40～45 ℃條件下進(jìn)行減壓濃縮，至浸膏狀無(wú)明顯乙醇味，得到中藥提取物浸膏；將中藥提取物浸膏與1,3-丁二醇(充當(dāng)溶劑作用)按質(zhì)量比例為1∶50混合，充分?jǐn)嚢枞芙夂筮^(guò)濾，得到組方提取物。

1.3.2 組方舒敏乳的制備

化妝品配方設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 舒敏乳組方Table 1 The formulation of cosmetic emulsions

續(xù)表2(Continued Tab.2)

制備工藝：稱取A相各物質(zhì)，混合并充分分散后，升溫至85 ℃，保溫30 min，備用；稱取B相各物質(zhì)，混合并加熱至75 ℃，完全溶解并攪拌均勻，備用；將B相加入到A相中，乳化3 min，乳化速度為3 000～4 000 rpm；將乳化后的料體緩慢攪拌降溫，至45 ℃加入C相各物質(zhì)，攪拌均勻；料體冷卻至室溫，出料灌裝。

1.4 組方提取物功效評(píng)價(jià)

1.4.1 透明質(zhì)酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)[9]

實(shí)驗(yàn)濃度分別采用1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%(組方提取物在體系中的質(zhì)量百分比)來(lái)測(cè)定組方提取物對(duì)透明質(zhì)酸酶活性抑制效果。

1.4.1.1 所需溶液配制

醋酸緩沖溶液：量取1.155 mL冰乙酸稀釋至100 mL混勻，取其中4.8 mL為A溶液；稱取2.72 g乙酸鈉結(jié)晶，加水溶解定容至100 mL混勻，取其中45.2 mL為B溶液；混合A、B溶液，以水定容至100 mL，混勻。

透明質(zhì)酸酶溶液：稱取10 mg透明質(zhì)酸酶于燒杯中，加入4 mL醋酸緩沖溶液，搖勻備用。

透明質(zhì)酸鈉溶液：稱取5 mg透明質(zhì)酸鈉于燒杯中，加入10 mL醋酸緩沖溶液，搖勻備用。

埃爾利希試劑(Ehrlich reagent)：稱取0.8 g對(duì)-二甲氨基苯甲醛，溶于15 mL濃鹽酸和15 mL無(wú)水乙醇中。

乙酰丙酮溶液：取3.5 mL乙酰丙酮，溶于50 mL 1.0 mol/L的碳酸鈉溶液中，用前配制。

1.4.1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取0.25 mmol/L的CaCl2溶液0.1 mL和透明質(zhì)酸酶溶液0.5 mL，37 ℃保溫培養(yǎng)20 min；加入不同濃度的組方提取物0.5 mL，繼續(xù)37 ℃保溫培養(yǎng)20 min；加入0.5 mL透明質(zhì)酸鈉液37 ℃保溫30 min，常溫放置5 min；加入0.1 mL 0.4 mol/L NaOH溶液和0.5 mL乙酰丙酮溶液，置于沸水浴中加熱15 min，立即用冰水冷卻5 min；加入埃爾利希試劑1.0 mL，并用3.0 mL無(wú)水乙醇進(jìn)行稀釋，放置顯色20 min，期間對(duì)試樣進(jìn)行450～700 nm范圍的波長(zhǎng)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)，在最大吸收波長(zhǎng)處用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值。樣品對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制率的計(jì)算公式如下：

式中：A1為參比溶液吸光值，用去離子水代替所得試樣；A2為參比空白溶液吸光值，用去離子水代替所得試樣，用醋酸緩沖溶液代替透明質(zhì)酸酶和透明質(zhì)酸鈉溶液；B1為試樣溶液吸光值；B2為試樣空白溶液吸光值，用醋酸緩沖溶液代替透明質(zhì)酸酶和透明質(zhì)酸鈉溶液。

1.4.2 自由基清除實(shí)驗(yàn)

1.4.2.1 清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)[10]

準(zhǔn)確稱取20 mg DPPH，用無(wú)水乙醇定容至250 mL，得到濃度為20 mmol/L的DPPH·溶液，將組方提取物分別用去離子水稀釋成不同濃度的測(cè)試液。取2 mL測(cè)試液和2 mL 20 mmol/L DPPH·溶液混勻，反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm波長(zhǎng)下吸光度的變化，對(duì)照溶劑用無(wú)水乙醇代替。樣品對(duì)DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下：

式中：A1為2 mL DPPH·溶液與2 mL不同濃度的組方提取物組成的混合液的吸光度；A2為2 mL DPPH·溶液與2 mL無(wú)水乙醇組成的混合液的吸光度；A3為2 mL不同濃度的組方提取物與2 mL無(wú)水乙醇組成的混合液的吸光度。

1.4.2.2 清除超氧陰離子自由基實(shí)驗(yàn)[11]

取0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL，于25 ℃水浴中放置20 min，分別加入1 mL不同濃度組方提取物溶液和25 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.4 mL，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，加入8 mol/L的HCl溶液1.0 mL終止反應(yīng)，以Tris-HCl緩沖液作參比，在299 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算清除率?？瞻讓?duì)照組以1 mL試樣溶劑代替樣品，每個(gè)處理均做三個(gè)重復(fù)。樣品對(duì)超氧陰離子自由基清除率的計(jì)算公式如下：

式中：A1為空白的平均吸光度；A2為組方提取物的平均吸光度。

1.4.2.3 清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)[12]

羥基自由基由Fenton反應(yīng)產(chǎn)生，·OH氧化水楊酸產(chǎn)生對(duì)510 nm有特征吸收的2,3-二羥基苯甲酸，通過(guò)測(cè)定水楊酸捕獲·OH所得到的產(chǎn)物確定·OH的清除率。在25 mL比色管中加入2 mmol/L FeSO4和1 mmol/L H2O2各3 mL，搖勻，再加入6 mmol/L 水楊酸3 mL，搖勻，于37 ℃水浴加熱15 min后取出，測(cè)其吸光度A1。然后分別加入不同濃度的組方提取物1mL，搖勻，繼續(xù)水浴加熱15 min，取出測(cè)其吸光度A2。

樣品對(duì)羥自由基清除率的計(jì)算公式：

其中：A1為空白的平均吸光度；A2為組方提取物的平均吸光度。

1.4.3 抑制KU812細(xì)胞中組胺釋放實(shí)驗(yàn)[13]

人外周血嗜堿性(KU812)細(xì)胞常被用作研究過(guò)敏反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，其與人體肥大細(xì)胞具有很大的相似性，適合用于建立人類肥大細(xì)胞激活和脫顆粒模型。實(shí)驗(yàn)采用KU812細(xì)胞組胺釋放模型，考查組方提取物對(duì)KU812細(xì)胞組胺釋放的影響。

1.4.3.1 樣品配制及處理

以DMSO配制組方提取物溶液，母液濃度為50 mg/mL，用時(shí)以含10%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋，高、中、低濃度為1 000、500、250 μg/mL。

1.4.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立

用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2.2×106個(gè)/mL，然后將得到的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔接種量為180 μL。分為模型對(duì)照組、組方提取物高、中、低劑量組、空白對(duì)照組、每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)靜置10 min，受試樣品組分別加入相應(yīng)濃度劑量的組方提取物溶液20 μL(終濃度分別為200、100、50 μg/mL)，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組分別加入20 μL培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中預(yù)溫孵，2 h后除細(xì)胞空白對(duì)照組外，各組細(xì)胞加入刺激劑40 nM巴豆醇、12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(PMA)、1 μm鈣離子載體A23187，PMA和A23187使用DMSO配制。空白對(duì)照組加入同體積含等濃度DMSO培養(yǎng)基。

1.4.3.3 指標(biāo)檢測(cè)

2 h后離心分離細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液，測(cè)定上清液中組胺含量。

1.5 組方舒敏乳功效評(píng)價(jià)

化妝品的功效宣稱應(yīng)當(dāng)有充分的科學(xué)依據(jù)，功效宣稱依據(jù)包括文獻(xiàn)資料、研究數(shù)據(jù)或者化妝品功效宣稱評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果等。

1.5.1 功效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方案

參照GB17149-1997《化妝品皮膚病診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則總則》，選取無(wú)診斷相關(guān)者。挑選符合篩選的受試者為試驗(yàn)對(duì)象，在鼻唇溝和左側(cè)面頰部局部應(yīng)用10%乳酸溶液，相應(yīng)的對(duì)照組用去離子水。鼻唇溝處角質(zhì)層通透性較高，附屬器官及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)豐富，刺痛感較明顯。在2.5 min及5 min時(shí)對(duì)受試者的瘙癢、刺痛、灼痛感的不適程度進(jìn)行四分法評(píng)定。刺痛程度(無(wú)：0；輕微：1；中度：2；重度：3)。如果兩次試驗(yàn)之和大于或等于3，則可判定受試者是刺痛敏感個(gè)體，屬于敏感性皮膚，將其納入功效評(píng)價(jià)受試人員名單，預(yù)計(jì)納入30人。試者每日早中晚清潔皮膚后凃組方舒敏乳于面部，早晚各1次。使用樣品第7天、14天、21天回訪，記錄數(shù)據(jù)及使用效果。

1.5.2 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用 SPSS軟件對(duì)各個(gè)測(cè)量值進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，包括數(shù)量、均值、標(biāo)準(zhǔn)差等。所有指標(biāo)數(shù)據(jù)，進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，分析使用產(chǎn)品前后皮膚參數(shù)是否具有顯著性差異。

1.5.3 皮水分散失量測(cè)試

通過(guò)經(jīng)皮水分散失速率測(cè)試探頭(Tewameter TM300&MPA 580)進(jìn)行測(cè)試，分析皮膚表面水分蒸發(fā)的速率(Tewl)。

1.5.4 皮膚角質(zhì)層含水量測(cè)試

通過(guò)角質(zhì)層水分含量測(cè)試探頭(Corneometer CM825&MPA 580)進(jìn)行測(cè)試?？梢苑治銎つw表面的含水量(C.U.)。

1.5.5 皮膚舒緩測(cè)試

通過(guò)皮膚黑色素和血紅素測(cè)試儀(Mexameter MX18&MPA 580)進(jìn)行測(cè)試，通過(guò)測(cè)試皮膚與受試物接觸后的紅斑指數(shù)，能夠間接反映皮膚的過(guò)敏程度，評(píng)價(jià)護(hù)膚品對(duì)皮膚炎癥的改善情況。

1.5.6 抗敏修復(fù)測(cè)試

在納入功效評(píng)價(jià)名單中，隨機(jī)選取16名志愿者，前臂內(nèi)側(cè)皮膚作為受試部位，在每個(gè)斑試器內(nèi)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液，貼于受試者左前臂內(nèi)側(cè)皮膚，受試5 h，取下斑試器，半小時(shí)后觀察皮膚變化，并記錄；取25 μL舒敏乳加入斑試器中，空白對(duì)照為25 μL生理鹽水，然后將各斑試器貼敷于受試部位。試驗(yàn)時(shí)間為 24 h，在斑試器貼敷24 h后去除，等待30 min 后觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。48 h時(shí)后再觀察一次，記錄測(cè)試結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 組方提取物功效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 抑制透明質(zhì)酸酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

機(jī)體發(fā)生過(guò)敏性疾病或產(chǎn)生炎癥時(shí)，肥大細(xì)胞中作為化學(xué)傳遞物質(zhì)的組胺起著重要作用。通過(guò)測(cè)定組胺的濃度，可評(píng)價(jià)樣品抗過(guò)敏效果。研究表明，透明質(zhì)酸酶活性越高，組胺的釋放量就越高，透明質(zhì)酸酶活性抑制和肥大細(xì)胞釋放組胺抑制活性之間具有很好的相關(guān)性。

圖1 提取物對(duì)透明質(zhì)酸酶活性抑制作用Fig.1 Inhibition effect of extracts on hyaluronidase activity

組方提取物對(duì)透明質(zhì)酸酶活性抑制結(jié)果見(jiàn)圖1，從圖中可以看出，隨著組方提取物濃度的增大，透明質(zhì)酸酶抑制率也在逐漸增大，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的組方提取物對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制率達(dá)80.06%，當(dāng)濃度達(dá)到8%時(shí)，抑制率達(dá)到88.92%，并呈一定的量效關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：組方提取物對(duì)透明質(zhì)酸酶活性有較好的抑制作用。鑒于8%的添加量在實(shí)際配方用量太高，綜合考慮功效及性價(jià)比，故在以下實(shí)驗(yàn)中將最高量初步定為6%。

2.1.2 清除自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.2.1 清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 提取物的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging rate of extracts

組方提取物對(duì)DPPH自由基清除率結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖中可以看出，隨著組方提取物濃度的增大，DPPH自由基清除率也在逐漸增大。在組方提取物濃度為3%時(shí)，清除率為75.6%，當(dāng)濃度為6%時(shí)，清除率達(dá)到90.1%。結(jié)果表明：組方提取物對(duì)DPPH自由基有較好的清除作用。

2.1.2.2 清除超氧陰離子自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 提取物的超氧陰離子自由基清除率 radical scavenging rate of extracts

組方提取物對(duì)超氧陰離子自由基清除率結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢钥闯?，組方提取物具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力，在組方提取物濃度達(dá)到6%時(shí)，清除率達(dá)到72.1%，且對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用隨濃度增加而增強(qiáng)。這表明組方提取物對(duì)超氧陰離子自由基同樣有較好的清除作用。

2.1.2.3 清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 提取物的羥自由基清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging rate of extracts

利用Fenton反應(yīng)，檢測(cè)組方提取物對(duì)羥基自由基的清除作用，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖中可以看出，當(dāng)組方提取物濃度為6%時(shí)，清除率達(dá)到74.8%，且對(duì)羥自由基的清除作用隨濃度增加而增強(qiáng)。結(jié)果表明：組方提取物對(duì)羥自由基也有較好的清除作用。

2.2 抑制KU812細(xì)胞中組胺釋放結(jié)果

在過(guò)敏和炎癥反應(yīng)中，肥大細(xì)胞脫顆粒后釋放的活性介質(zhì)可以直接參與過(guò)敏反應(yīng)，由于嗜堿性細(xì)胞系KU812與肥大細(xì)胞具有高度相似性，適合用于建立人類肥大細(xì)胞激活和脫顆粒模型。KU812細(xì)胞活化導(dǎo)致細(xì)胞脫顆粒，化學(xué)介質(zhì)釋放如組胺等促炎細(xì)胞因子。這些分子作用于血管、平滑肌等，擴(kuò)大和維持炎癥反應(yīng)，肥大細(xì)胞脫顆粒和一些細(xì)胞因子合成，完全依賴鈣流動(dòng)，本實(shí)驗(yàn)采用PMA和鈣離子載體聯(lián)合刺激KU812細(xì)胞，造成細(xì)胞內(nèi)鈣升高，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒。因此，本實(shí)驗(yàn)建立PMA和A23187聯(lián)合誘導(dǎo)KU812細(xì)胞組胺釋放模型，用來(lái)評(píng)價(jià)提取物對(duì)組胺釋放的影響。組方提取物抑制KU812細(xì)胞中組胺釋放量實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 組方提取物對(duì)組胺釋放的影響Table 2 Effect of group extracts on histamine release

從表中可以看出，經(jīng)PMA和A23187聯(lián)合誘導(dǎo)后，模型對(duì)照組組胺含量明顯升高，與空白對(duì)照組相比有極顯著性差異(P<0.01)。添加組方提取物后，組胺釋放量明顯降低，高、中劑量組較模型組有極顯著性差異(P<0.01)，低劑量組與模型組相比呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。這表明組方提取物能有效抑制組胺釋放量，具有一定的抗敏舒敏功效。

依據(jù)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，組方提取物在使用濃度為6%時(shí)，具有良好的清除透明質(zhì)酸酶、清除自由基、抑制組胺釋放功效。為使舒敏乳能體現(xiàn)出較好的人體功效評(píng)價(jià)結(jié)果，綜合性價(jià)比，在制備舒敏乳中組方提取物添加量初步定為6%。

2.3 組方舒敏乳功效評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1 經(jīng)皮水分散失測(cè)試結(jié)果

測(cè)試期內(nèi)，不同測(cè)試區(qū)域經(jīng)皮水分散失量隨時(shí)間變化情況如圖5。經(jīng)皮水分散失量越低，表明皮膚屏障功能越好，組方舒敏乳的舒敏修復(fù)效果越好?？傮w結(jié)果見(jiàn)圖6，樣品在第7天、第14天和第21天與本底值相比有極顯著差異(P<0.01)，這表明受試樣品具有顯著減少經(jīng)皮水分散失、修復(fù)并增強(qiáng)皮膚屏障的功效。

圖5 不同區(qū)域經(jīng)皮水分散失Fig.5 Trans-epidermal water loss in different areas

圖6 總區(qū)域經(jīng)皮水分散失Fig.6 Trans-epidermal water loss in general areas注：與0天相比，**P<0.01(下同)。Note:Compared with dya 0,**P<0.01 (the same below).

2.3.2 皮膚含水量測(cè)試結(jié)果

測(cè)試期內(nèi)，不同測(cè)試區(qū)域水分含量隨時(shí)間變化情況如圖7。測(cè)試期內(nèi)額頭、臉頰、下顎的含水量都有所增加，這表明受試樣品的舒敏功能良好，且有一定的補(bǔ)水效果?？傮w實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8，樣品在第7天、第14天和第21天與本底值相比存在顯著差異(P<0.01)，這表明受試樣品具有顯著提高皮膚含水量、增強(qiáng)皮膚屏障的功效。

圖7 不同區(qū)域皮膚含水量Fig.7 Skin hydration in different areas

圖8 總區(qū)域皮膚含水量Fig.8 Skin hydration in general areas

2.3.3 皮膚舒緩測(cè)試結(jié)果

測(cè)試期內(nèi)，不同測(cè)試區(qū)域皮膚血紅素值隨時(shí)間變化情況如圖9。測(cè)試期內(nèi)額頭、臉頰、下顎的皮膚血紅素含量都呈下降趨勢(shì)，表明測(cè)試區(qū)域皮膚敏感的改善?？傮w結(jié)果見(jiàn)圖10，樣品在第7天、第14天和第21天相對(duì)于本底值存在顯著性差異(P<0.01)，這表明樣品具有顯著的舒緩肌膚功效。

圖9 不同區(qū)域皮膚血紅素Fig.9 Skin heme in different areas

圖10 總區(qū)域皮膚血紅素Fig.10 Skin heme in general areas

2.3.4 抗敏修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

十二烷基硫酸鈉(SDS)是一種陰離子表面活性劑，是一種常用的皮膚刺激劑。用十二烷基硫酸鈉斑貼測(cè)試的皮膚敏感性評(píng)價(jià)，已成為研究刺激性接觸性皮炎經(jīng)典模型[14]。本研究的目的是在封閉性的條件下，用10% SDS斑貼作用于皮膚5 h，去除10%SDS斑貼，以建立皮膚過(guò)敏模型；再將舒敏乳貼附于同位置皮膚上進(jìn)行修復(fù)，隨著時(shí)間的推移，觀察皮膚的變化情況，對(duì)皮膚的反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。

由表3中的結(jié)果可以直觀看出：雖存在個(gè)體差異性，不同受試者的使用效果有所不同，但整體情況表明該乳液在舒敏方面效果良好。

3 結(jié)論

本文在前期研究基礎(chǔ)上對(duì)香薷、山慈菇、獨(dú)活、三棱、孩兒茶、遠(yuǎn)志六味中藥提取制備得到組方提取物，利用抑制透明質(zhì)酸酶活性實(shí)驗(yàn)，清除超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基實(shí)驗(yàn)，抑制組胺釋放實(shí)驗(yàn)，探究組方提取物活性和作用機(jī)理。結(jié)果顯示，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的組方提取物對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制率達(dá)80.06%，對(duì)超氧陰離子、羥自由基、DPPH自由基清除率均在70%以上；濃度為200 μg/mL的組方提取物抑制組胺釋放率達(dá)52%，這表明組方提取物對(duì)透明質(zhì)酸酶、三種自由基及組胺釋放均有一定的抑制或清除作用。

表3 受試者皮膚反應(yīng)結(jié)果Table 3 Results of the skin response in the subjects

將組方提取物添加到乳液配方中，對(duì)舒敏乳液進(jìn)行了相關(guān)人體功效評(píng)價(jià)，以驗(yàn)證其對(duì)皮膚過(guò)敏癥狀的舒緩效果。結(jié)果表明，添加組方提取物乳液能顯著減少皮膚血紅素值(P<0.01)，減少皮膚水分散失(P<0.01)，提高皮膚水分含量(P<0.01)，有效改善皮膚過(guò)敏癥狀。

綜上所述，該組方提取物能有效抑制引發(fā)皮膚過(guò)敏反應(yīng)物質(zhì)的活性，緩解皮膚過(guò)敏癥狀，快速修復(fù)皮膚，增強(qiáng)皮膚屏障功能，是一款較為理想的化妝品用植物源原料。