萬祥宏，蔡沐彬，游清徽

江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330022

Janus激酶(Janus kinase，JAKs)屬于細胞內(nèi)酪氨酸激酶家族，由JAK1、JAK2、JAK3和TYK2四個成員組成，在許多細胞因子受體的信號傳遞過程中起著中樞作用[1]。通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activators of transcription，STATs)啟動下游靶基因，進而發(fā)揮其細胞生物功能的調(diào)控作用[2]。JAK-STAT信號通路在細胞的增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等重要生物學(xué)過程均有參與，JAK-STAT信號通路的異常激活會加速癌細胞的增殖過程，例如急性早幼粒細胞白血病，其細胞系HT93A誘導(dǎo)分化時就會激活JAK-STAT，導(dǎo)致其增殖加快[3]。JAK-STAT通道還會被NADPH氧化酶激活，使得肝X受體的表達水平下降，大大影響了ATP三磷酸腺苷結(jié)合盒(AB-CA1)的表達，抑制THP-1泡沫細胞膽固醇的排出，導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)病[4]。目前醫(yī)藥領(lǐng)域與之相關(guān)的研究多集中于癌癥、炎癥和心血管疾病，其中炎癥性疾病主要包括潰瘍性結(jié)腸炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及克羅恩病等。

JAK蛋白作為人體中重要的一種蛋白，靶點JAK蛋白設(shè)計的小分子抑制劑有許多，然而大多數(shù)由于口服生物利用率低、選擇性差等缺點都處于臨床的不同研究階段，獲得監(jiān)管部門批準(zhǔn)的上市JAK抑制劑迄今為止僅有兩個[5]。托法替尼(tofacitinib)是美國輝瑞公司研發(fā)的一種新型的JAK1/3抑制劑，于2012年11月6日獲得美國FDA批準(zhǔn)上市，之后于2013年3月25日獲得日本PMDA批準(zhǔn)上市。托法替尼作為第一代JAK抑制劑，通過抑制細胞質(zhì)受體的下游信號來阻斷細胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]，達到干擾JAK-STAT信號通路從而影響DNA轉(zhuǎn)錄的目的，在抗增殖和抗炎癥方面發(fā)揮了明顯的作用。雖然該藥物已經(jīng)在臨床上得到廣泛應(yīng)用，療效較好，但是在對疾病有效的同時，也產(chǎn)生了不良反應(yīng)，包括但不限于腸胃不適、惡心、嘔吐、貧血、發(fā)熱、上呼吸道感染、肝酶和血脂升高，嚴重的還可能導(dǎo)致呼吸困難。不僅如此，托法替尼與強效免疫抑制劑例如他克莫司，環(huán)孢素合用還有增加免疫抑制作用的風(fēng)險，導(dǎo)致藥物副作用加劇。

JAK3是JAK家族中唯一與細胞因子受體γc鏈相關(guān)聯(lián)的家族成員[7]。由于JAK3在細胞因子信號傳遞中具有極其重要的作用，且其僅在特定的組織中進行表達，因而抑制JAK3活性后導(dǎo)致免疫抑制但不會引發(fā)更多的非正常生理變化，這使得JAK3成為研究免疫抑制劑的重要靶標(biāo)[8]。因此，開發(fā)療效確切、毒副作用輕微的JAK3抑制劑類藥物的需求仍十分迫切。通過分子對接虛擬篩選與托法替尼具有相似結(jié)合位點的中草藥成分小分子，有望獲得JAK3特異性抑制劑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 JAK蛋白

JAK家族中的四種蛋白的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來自RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)，JAK1、JAK2、JAK3和TYK2蛋白的PDB ID分別為6SM8、3FUP、3LXK和3LXN。所有結(jié)構(gòu)都是具有藥物結(jié)合的復(fù)合體，其中3FUP、3LXK和3LXN結(jié)合的是藥物托法替尼。

PDB ID為6SM8和3FUP的蛋白是同源多聚體，只保留結(jié)構(gòu)最完整的A鏈。

1.1.2 中草藥成分小分子

中草藥成分小分子結(jié)構(gòu)文件從TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/)下載，一共有13 445種小分子，下載格式為MOL2。

1.2 研究方法

1.2.1 分子對接

分子對接是結(jié)構(gòu)生物學(xué)和計算機輔助藥物設(shè)計的關(guān)鍵工具，通過預(yù)測出受體和配體的結(jié)合構(gòu)象和親和力來進行小分子改造和設(shè)計分子對接[9]。常見的分子對接工具有AutoDock、LeDock、MOE Dock、FlexX等。

本研究利用LeDock軟件(http://www.lephar.com/)對中草藥成分小分子與JAK3進行模擬對接。LeDock是由趙洪桃博士開發(fā)的分子對接軟件，其優(yōu)點是小分子與蛋白質(zhì)對接既快速又準(zhǔn)確[10]。

對接盒子由GetBox-PyMol-Plugin插件(http://bioms.org/thread-1234-1-1.html)自動識別含配體的蛋白活性空腔確定。

1.2.2 圖表繪制

本研究中的表格以Excel軟件繪制，圖片由PyMOL2.3.0和Molecular Operating Environment (MOE) 2019.0102導(dǎo)出。

2 結(jié)果與分析

利用LeDock軟件進行分子對接，得到13 445種小分子與JAK3蛋白的對接結(jié)果。

2.1 對接結(jié)果的初步處理

考慮分子對接計算算法的近似性處理和配體結(jié)合蛋白時候復(fù)雜的熱力學(xué)、動力學(xué)性質(zhì)導(dǎo)致很多預(yù)測結(jié)果并沒有顯示出生物活性，為控制篩選結(jié)果的假陽性，使用配體結(jié)合效率(ligand efficiency，LE)和結(jié)合能打分值來進行篩選[10]。對接結(jié)果以結(jié)合能打分值小于-6.0且配體結(jié)合效率大于0.4或結(jié)合能打分值小于-7.5且配體結(jié)合效率大于0.3作為范圍進行過濾，初步篩選出118種小分子。

2.2 對接結(jié)果的進一步處理

2.2.1 結(jié)構(gòu)篩選

由于硫酸根、磷酸根、酚羥基與蛋白質(zhì)的結(jié)合特異性差，作為藥物的副作用大，含有這些基團的小分子不適合作為JAK3特異性抑制劑。通過查找并分析結(jié)構(gòu)，排除含有以上基團的小分子，得到40種符合條件的分子。

2.2.2 研究相關(guān)性篩選

根據(jù)分子的編號、名稱、結(jié)構(gòu)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/)、藥源網(wǎng)(https://www.yaopinnet.com/)等進行查找，選擇對相關(guān)疾病有潛在治療效果，且已經(jīng)作為藥物、保健品成分或已有制備工藝的分子，得到18種小分子進行后續(xù)研究。

2.2.3 氫鍵數(shù)目篩選

用PyMOL保存18種小分子與3LXK蛋白結(jié)合的最佳構(gòu)象，再用MOE軟件展現(xiàn)小分子與活性位點氨基酸殘基的相互作用，得到氫鍵數(shù)量等數(shù)據(jù)。分析對接結(jié)果，并與托法替尼進行對比，18種小分子以及托法替尼與3LXK的對接結(jié)合能、氫鍵數(shù)量及配體效率見表1。

表1 18種小分子與3LXK的對接結(jié)合能、氫鍵數(shù)量及配體效率Table 1 Docking binding energy,number of hydrogen bonds,and ligand efficiency of 18 small molecules and tofacitinib with 3LXK

氫鍵是維系蛋白質(zhì)與配體分子結(jié)合穩(wěn)定性的重要作用力[11]。小分子在靶蛋白活性空腔內(nèi)與氨基酸殘基形成的氫鍵數(shù)作為反映結(jié)合能力的另一指標(biāo)，并比較采用托法替尼分子進行對接的打分值和配體結(jié)合效率，形成氫鍵數(shù)目越多，對接打分值越低，配體效率越高，則小分子與靶蛋白的結(jié)合能力越強。根據(jù)數(shù)值排名得出與JAK3的結(jié)合具有優(yōu)勢的7種小分子，相關(guān)信息見表2。利用MOE軟件可視化配體小分子在靶蛋白活性空腔中與相關(guān)氨基酸殘基的相互作用，得到分子對接結(jié)果見圖1。

M1(戊二酸)與JAK3之間通過9個氫鍵相連，是所有配體分子中氫鍵數(shù)最多的。其中Leu905、Ala966、Lys830、Asn832、Asn954作為氫供體；Leu905、Asn832、Arg953、Asn954作為氫接受體。此外Leu828更是與配體分子形成pi-H鍵，使二者之間的結(jié)合更加緊密。二者之間的對接結(jié)合能更是只有-11.3 kcal/mol遠遠低于托法替尼的-7.5 kcal/mol。

M2(葉酸)與JAK3之間共有8個氫鍵相連，其對接結(jié)合能也低于托法替尼，僅有-10.6 kcal/mol。其中Arg953、Ala966、Pro906、Lys830、Glu903、Lys830、Asp967作為氫供體；Leu905作為氫受體。

M3(斷馬錢子苷)與JAK3之間的對接結(jié)合能為-8.28 kcal/mol，其中Asp967、Ala966、Leu905、Lys830、Leu905 作為氫供體分別形成一個氫鍵，Glu 903在結(jié)合時提供了兩個氫，此外，Lys830與Leu905為氫受體，一共形成7個氫鍵。

M4(巴豆苷)與JAK3的對接結(jié)合能為-7.57 kcal/mol稍高于托法替尼與JAK3結(jié)合的結(jié)合能，其中Met902、Ala966、Arg953、Leu828作為氫供體分別形成一個氫鍵，Glu 903則在結(jié)合時提供了兩個氫，Leu905作為氫受體，一共形成7個氫鍵。

M5(2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-抗壞血酸)與JAK3的對接結(jié)合能稍高于托法替尼的結(jié)合能，為-7.51 kcal/mol，其中Arg953、Asp967、Asp949、Leu828作為氫供體分別形成一個氫鍵，Asn954則在結(jié)合時提供了兩個氫，Arg953作為氫受體，一共形成7個氫鍵。

M6(色胺)與JAK3的對接結(jié)合能為-8.14 kcal/mol，其中Ala966、Glu 903、Asn954作為氫供體分別形成1個氫鍵，Arg953在結(jié)合時提供了兩個氫，此外，Asn954、Asp967為氫受體，一共形成6個氫鍵。

M7(仙人掌黃質(zhì)-1)與JAK3的對接結(jié)合能為-8.09 kcal/mol，Ala966、Leu828、Glu903、Lys830作為氫供體分別形成一個氫鍵，Asp967則在結(jié)合時提供了個氫，一共形成6個氫鍵。

分析小分子與JAK3蛋白的結(jié)合效果，反映其被篩選作為苗頭化合物對JAK3的抑制作用，并且發(fā)現(xiàn)JAK3蛋白活性位點處氨基酸殘基中，Arg953、Asp967、Lys830、Ala966和Asn954最容易與小分子配體的H、O原子形成氫鍵作用。這些氨基酸殘基在與小分子結(jié)合時發(fā)揮較為重要的作用，尤其以Arg953和Ala966與小分子配體形成氫鍵的機會最大，此外范得華力和靜電相互作用等非鍵相互作用在酶活性中心與小分子配體形成穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象中也起了非常重要的作用[13]。

表2 7種優(yōu)勢小分子的相關(guān)信息Table 2 Related information of 7 best small molecules

2.3 高選擇性篩選

為使小分子能與JAK3蛋白較好結(jié)合的同時，減小對其他JAK家族蛋白的影響，進行相應(yīng)的高選擇性篩選。以JAK1、JAK2、TYK2為靶蛋白，將M1～M7這7種小分子分別與這三個蛋白對接，結(jié)果見表3，篩選出僅與JAK3對接效果好，與其他JAK3家族蛋白對接效果差的小分子，從而獲得JAK3激酶的高選擇性抑制劑。

表3 7種小分子與JAK1、JAK2、TYK2的對接結(jié)合能及配體效率Table 3 Docking binding energy and ligand efficiency of 7 small molecules with JAK1,JAK2 and Tyk2

續(xù)表3(Continued Tab.3)

圖1 小分子與JAK3蛋白的分子對接圖Fig.1 Molecular docking diagram of small molecules and JAK3 protein注：A～H分別為戊二酸、葉酸、斷馬錢子苷、巴豆苷、2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-抗壞血酸、仙人掌黃質(zhì)-I和托法替尼與JAK3蛋白的分子對接圖。Note: A～H are the molecular docking respectively picture of glutaric acid,folic acid,secologanin,crotonoside,2-O-(β-D-glucopyranosyl)-ascorbic acid,tryptamine,vulgaxanthin-I,tofacitinib and JAK3 protein.

以對接打分值小于-7.5且配體結(jié)合率大于0.3作為小分子與靶蛋白對接效果好的大致標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)M6與三個靶蛋白對接效果好；M1、M2、M7與兩個靶蛋白對接效果好(其中M1、M2與JAK1和TYK2對接效果好，M7與JAK1和JAK2對接效果好)；M4、M5只與其中一個靶蛋白對接效果好，對應(yīng)分別是JAK2、TYK2蛋白。最終，只有M3(斷馬錢子苷，secologanin)與三個靶蛋白對接效果差，展現(xiàn)其與JAK3蛋白的高選擇性結(jié)合(見圖2)。

為進一步驗證斷馬錢子苷的高選擇性，在參考軟件算法輔助打分的基礎(chǔ)上，利用MOE軟件，展現(xiàn)活性空腔內(nèi)小分子與周圍氨基酸殘基的相互作用，并借助其report功能，得到各氫鍵的作用力大小，驗證可得：相比于其他JAK家族蛋白，斷馬錢子苷在JAK3蛋白活性空腔內(nèi)，與周圍氨基酸殘基產(chǎn)生更多更強的氫鍵作用力，更穩(wěn)定地結(jié)合在其中，證實了它對JAK3蛋白高選擇性的抑制作用。

3 討論與結(jié)論

以上對接結(jié)果顯示，中草藥成分小分子戊二酸(glutaric acid)、葉酸(folic acid)、斷馬錢子苷(secologanin)、巴豆苷(crotonoside)、2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-抗壞血酸(2-O-(β-D-glucopyranosyl)-ascorbic acid)、色胺(tryptamine)、仙人掌黃質(zhì)- I(vulgaxanthin- I)與JAK3激酶的結(jié)合能力強于托法替尼(Tofacitinib)，可以作為候選的JAK3激酶抑制劑。對結(jié)合位點進行匯總分析發(fā)現(xiàn)，JAK3激酶活性空腔中的Arg953、Asp967、Lys830、Ala966和Asn954氨基酸殘基容易與小分子抑制劑的H、O原子形成氫鍵作用，是JAK3抑制劑的開發(fā)設(shè)計的關(guān)鍵。

在7種小分子中，斷馬錢子苷(secologanin)與其他JAK家族蛋白對接結(jié)合效果差，表現(xiàn)出與JAK3蛋白結(jié)合的高選擇性，有進一步研究設(shè)計成為JAK3激酶特異性抑制劑的價值。斷馬錢子苷存在于金銀花[15]和馬錢子等植物中。金銀花(LoniceraeJaponicaeFlos)是我國的傳統(tǒng)中藥，具有增強免疫力、抗腫瘤、降血糖血脂、消炎、解熱等功效[15]，藥用歷史悠久，臨床用途十分廣泛；馬錢子(Strychnosnux-vomicaL.)被研究發(fā)現(xiàn)能夠影響與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病有關(guān)的JAK-STAT通路[16]。根據(jù)本研究的結(jié)果，斷馬錢子苷可能具備與托法替尼類似的藥理機制，通過與JAK3蛋白結(jié)合，抑制JAK磷酸化，進而抑制STAT磷酸化，從而阻斷JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制多種炎癥細胞因子的合成與分泌，達到抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用[17]。托法替尼對JAK1和JAK3激酶都能發(fā)揮抑制作用，而斷馬錢子苷與JAK3的結(jié)合作用具有高度選擇性，作為JAK3激酶抑制劑的特異性更強。此外，斷馬錢子苷還是金銀花等常用中藥的成分，具有綠色性、易獲取、毒副作用小等特點，值得作為JAK3特異性抑制劑進行深入研究。

圖2 斷馬錢子苷與JAK3的相互作用Fig.2 The interaction between secologanin and JAK3