蘆曉芳，唐雨薇，高春艷，張永坡，岳愛(ài)琴，趙晉忠

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，太谷 030801

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)莧科藜屬雙子葉植物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，具有營(yíng)養(yǎng)成分全面、保健功效顯著、耐逆境脅迫能力強(qiáng)等特點(diǎn)[1]。其中皂苷是其主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]，它具有抗氧化清除自由基、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗真菌等生物活性，可作為制藥工業(yè)原料[3,4]。在藜麥皂苷生物活性的研究上，多為抗氧化活性、抑菌活性以及免疫增強(qiáng)等方面[5]?；趥鹘y(tǒng)提取法，Dong等[6]通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)，獲得藜麥麩皮總皂苷的最佳提取工藝組合：乙醇濃度75%、超聲溫度45 ℃、料液比15 mL/g、超聲時(shí)間1.5 h，此條件下皂苷得率可達(dá)(2.370+0.022)%。Du等[7,8]利用高速逆流色譜法，分離得到藜麥種皮皂苷。為進(jìn)一步提高藜麥皂苷的提取率，國(guó)內(nèi)外學(xué)者引入超聲、微波等輔助作用[9]達(dá)到改進(jìn)藜麥皂苷的提取方法。

本文以白藜麥籽粒為原料，基于超聲輔助提取法，引入外加負(fù)壓，探尋超聲時(shí)間、溫度及負(fù)壓等操作條件對(duì)藜麥皂苷提取率的影響，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)獲得超聲-負(fù)壓輔助提取藜麥皂苷的最佳工藝條件，為藜麥皂苷的提取及相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)高效、綠色提取提供數(shù)據(jù)支撐。采用飽和正丁醇萃取法分離純化藜麥皂苷粗提物，得到藜麥總皂苷，對(duì)其進(jìn)行體外活性實(shí)驗(yàn)，考察其體外抗氧化活性，這將為藜麥皂苷的生產(chǎn)制備及在醫(yī)藥和功能食品開(kāi)發(fā)應(yīng)用及其作用機(jī)制提供重要參考依據(jù)，也有利于其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用，擴(kuò)大藜麥的應(yīng)用范圍及商業(yè)價(jià)值，達(dá)到藜麥資源的充分、高效利用。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料與儀器

齊墩果酸標(biāo)品(110709-201607，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)(PRPDE-JO，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；其他試劑均為分析純。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)；UV1100分光光度計(jì)(長(zhǎng)沙科美分析儀器有限公司)；DL-0506低溫冷卻液循環(huán)泵(河南兄弟儀器設(shè)備有限公司)；YRE2000E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵(鄭州予華儀器制造有限公司)；YXSF-500中藥粉碎機(jī)(上海百航實(shí)業(yè)有限公司)；KM-300DE中文液晶臺(tái)式超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司)；掃描電子顯微鏡VEGA Ⅱ RSU型(TESCAN公司)。

1.2 測(cè)試方法

1.2.1 材料預(yù)處理

白藜麥種子(山西嵐縣)粉碎后過(guò)孔徑0.42 mm篩，制得藜麥粉末。將藜麥粉末置于石油醚中浸泡過(guò)夜，反復(fù)2～3次，至石油醚溶液無(wú)色為止，抽濾后自然晾干，即為脫脂藜麥粉末樣品，備用。

1.2.2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取4.000 0 mg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，無(wú)水甲醇溶解并定容，得到濃度0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別準(zhǔn)確吸取0、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90 mL的齊墩果酸甲醇溶液，置于20 mL具塞試管中，70 ℃水浴揮干溶劑，冰水浴中冷卻后，加入0.20 mL 5%的香草醛-冰醋酸顯色劑和0.80 mL 80%濃硫酸，搖勻；70 ℃水浴加熱15 min，冰水浴冷卻后加入5.00 mL冰醋酸稀釋?zhuān)瑩u勻，靜置15 min；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于分光光度計(jì)300～900 nm處進(jìn)行掃描，選定最大吸收波長(zhǎng)，即為檢測(cè)波長(zhǎng)；以空白為對(duì)照，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，建立回歸方程[10]。

1.2.3 樣品溶液的制備

1.000 0 g去脂藜麥粉末中加入20.00 mL濃度為70%的乙醇溶液，于一定的超聲時(shí)間、超聲溫度和附加負(fù)壓條件下提取藜麥皂苷，過(guò)濾，將濾液置于70 ℃水浴鍋上水浴蒸干，用甲醇溶解并定容至25.00 mL，即得樣品溶液。

1.2.4 藜麥皂苷含量的測(cè)定

準(zhǔn)確量取0.25 mL樣品溶液置于20.00 mL具塞試管中，70 ℃ 水浴揮干溶劑，采用“1.2.2”的方法，最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算得到皂苷濃度。

1.2.5 皂苷得率計(jì)算

藜麥皂苷得率計(jì)算如公式(1)所示。

(1)

式中，皂苷得率的單位為mg/g；C表示根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得的皂苷濃度(mg/mL)；V表示提取液總體積(mL)；m表示樣品質(zhì)量(g)。

1.2.6 藜麥皂苷提取的單因素試驗(yàn)

精密稱(chēng)取脫脂藜麥粉末1.000 0 g，按表1所示考察超聲時(shí)間、超聲溫度和負(fù)壓等單因素條件對(duì)藜麥皂苷提取得率的影響。乙醇濃度70%，料液比1∶20，超聲功率270 W，超聲溫度40 ℃時(shí)，考察超聲時(shí)間對(duì)皂苷得率的影響；乙醇濃度70%，料液比1∶20，超聲功率270 W，超聲20 min時(shí)，考察超聲溫度對(duì)皂苷得率的影響；乙醇濃度70%，料液比1∶20，超聲功率270 W，負(fù)壓10 min，超聲20 min，超聲溫度60 ℃時(shí)，考察負(fù)壓對(duì)皂苷得率的影響。采用“1.2.4”方法測(cè)定藜麥皂苷的濃度，采用“1.2.5”方法計(jì)算藜麥皂苷得率。

1.2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

在基于單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取上述三個(gè)影響因素為自變量，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

1.2.8 藜麥總皂苷SEM表征

利用掃描電子顯微鏡分析和描述藜麥籽粒細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)在不同提取條件下提取皂苷后的變化。SEM表征檢測(cè)條件為：加速電壓(HV)20.0 kV，工作距離(WD)7.08 mm，放大(MAG)200 kx。

表1 藜麥皂苷提取單因素實(shí)驗(yàn)條件(n=3)Table 1 Single factor experimental conditions for extraction of quinoa saponin (n=3)

1.2.9 藜麥皂苷的純化

藜麥皂苷純化過(guò)程中，針對(duì)大孔樹(shù)脂吸附法分離純化效率低和硅膠柱層析法易吸附難脫附的局限，采用正丁醇萃取法精制藜麥皂苷，具體步驟：甲醇溶解藜麥皂苷粗提物，水飽和的正丁醇溶液萃取，合并正丁醇萃取液，旋蒸冷卻，藜麥皂苷析出。經(jīng)正丁醇萃取得到的藜麥皂苷純度及產(chǎn)量都顯著高于大孔樹(shù)脂吸附法和硅膠柱層析法。

1.2.10 藜麥總皂苷活性

將樣品母液稀釋不同倍數(shù)，以Vc為陽(yáng)性對(duì)照分析藜麥皂苷的抗氧化活性。采用普魯士藍(lán)顯色法[11]通過(guò)皂苷還原Fe3+能力評(píng)價(jià)皂苷總還原力；皂苷對(duì)清除DPPH自由基的能力按Bai等[12]的方法評(píng)價(jià)。

(2)

式中，Ac表示未加樣品溶液的DPPH溶液的吸光度；Ai表示藜麥皂苷樣品或抗壞血酸與DPPH試劑混合液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以O(shè)rigin 2017繪制單因素試驗(yàn)等圖表(n=3)采用Design Expert 12 軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

按照“1.2.1”的方法將齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色后，用紫外分光光度計(jì)在300～900 nm處進(jìn)行掃描，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和藜麥皂苷提取液顯色后吸收曲線(xiàn)圖如圖1a和1b所示。由圖1a可知，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品在551 nm附近有最大吸收，由圖1b可知，藜麥皂苷提取液在551 nm附近有較大吸收，確定551 nm為其最大吸收波長(zhǎng)。

2.2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖2所示，由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=66.74x-0.034 19，R2=0.998 7，在此范圍內(nèi)(0～0.03 mg/mL)有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)和藜麥皂苷提取液(b)顯色后吸收曲線(xiàn)Fig.1 Absorption curve of oleanolic acid standard solution (a) and quinoa saponin extract (b) after coloration

該齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可用于檢測(cè)樣品中藜麥皂苷含量范圍為0～14.40 mg/g。

圖2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 Standard curve of oleanolic acid

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 超聲時(shí)間對(duì)藜麥總皂苷得率的影響

乙醇濃度70%、料液比1∶20、超聲功率270 W和超聲溫度40 ℃條件下，超聲時(shí)間對(duì)藜麥總皂苷提取得率的影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，超聲時(shí)間為5 min到20 min之間時(shí)，皂苷得率隨超聲時(shí)間的增加整體呈增加的趨勢(shì)；當(dāng)超聲時(shí)間由20 min到25 min時(shí)，藜麥皂苷得率隨時(shí)間的增加呈減少趨勢(shì)。這可能是因?yàn)楫?dāng)超聲時(shí)間較短時(shí)，藜麥中皂苷的提取率隨著時(shí)間的增加而增多，而當(dāng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，提取量隨時(shí)間的變化不顯著，且超聲波有可能會(huì)對(duì)皂苷的結(jié)構(gòu)造成了破壞，導(dǎo)致皂苷得率下降。因此，超聲時(shí)間為20 min時(shí)是最優(yōu)提取條件，此時(shí)藜麥皂苷提取率達(dá)到10.58±0.007 mg/g。

圖3 超聲輔助提取法中超聲時(shí)間對(duì)藜麥總皂苷得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of saponins in ultrasound-assisted extraction

2.3.2 超聲溫度對(duì)藜麥總皂苷得率的影響

乙醇濃度70%、料液比1∶20、超聲功率270 W和超聲20 min條件下，超聲溫度對(duì)藜麥總皂苷得率的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，在超聲溫度在20 ℃到60 ℃的范圍內(nèi)，藜麥皂苷得率與超聲溫度呈正相關(guān)。因?yàn)樵碥赵诟邷叵赂兹芙猓珳囟冗^(guò)高可能會(huì)使皂苷失活，所以把超聲溫度為60 ℃作為最優(yōu)提取條件，此時(shí)藜麥皂苷提取率達(dá)到11.82±0.027 mg/g。

圖4 超聲輔助提取法中超聲溫度對(duì)藜麥總皂苷得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the yield of saponins in ultrasound-assisted extraction

2.3.3 負(fù)壓對(duì)藜麥總皂苷得率的影響

乙醇濃度70%、料液比1∶20、超聲功率270 W、超聲20 min、超聲溫度 60 ℃和負(fù)壓10 min條件下，負(fù)壓對(duì)藜麥皂苷得率的影響如圖5所示。由圖5可知，在負(fù)壓0.03 MPa到0.04 MPa以及0.06 MPa到0.07 MPa間皂苷得率與負(fù)壓呈正相關(guān)，在0.04 MPa到0.06 MPa間皂苷得率隨負(fù)壓增加呈下降趨勢(shì)，且整體誤差偏大，有可能是因?yàn)橥饧拥呢?fù)壓不好控制操作所導(dǎo)致的。因?yàn)樵谪?fù)壓為0.04 MPa時(shí)藜麥的皂苷得率最高，所以選擇0.04 MPa作為最優(yōu)提取條件，此時(shí)藜麥皂苷提取率達(dá)到11.83±0.025 mg/g。

圖5 超聲-負(fù)壓輔助提取法中外加負(fù)壓對(duì)藜麥總皂苷得率的影響Fig.5 Effect of negative pressure on the yield of saponins in ultrasonic-negative pressure assisted extraction

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

根據(jù)超聲-負(fù)壓輔助提取法的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取超聲時(shí)間、超聲溫度以及負(fù)壓三個(gè)因素，以藜麥皂苷得率為影響值，利用Design Expert 12軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平表見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平表Table 2 Box-Behnken test factor level

將各因素按表2所示的因素水平，通過(guò)響應(yīng)面分析法進(jìn)行三因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲-負(fù)壓輔助提取法的工藝條件，結(jié)果如表3所示。

通過(guò)Design Expert 12軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到藜麥皂苷得率與超聲時(shí)間(A)、超聲溫度(B)、負(fù)壓(C)之間的多元二次回歸模型方程為：

Y=12.12+0.066 7×A-0.101 8×B+0.200 2×C+0.033 9×AB-0.004 5×AC-0.052 0×BC-0.360 6×A2-0.810 7×B2-0.043 9×C2

試驗(yàn)結(jié)果方差分析如表4所示。由表4可知，模型的P值=0.003 2<0.01，回歸模型具有高度的顯著性，失擬值P=0.307 4>0.05，失擬不顯著，說(shuō)明二次響應(yīng)曲面回歸方程能夠很好地?cái)M合本試驗(yàn)所得的結(jié)果。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design and results

由表4可知，二次項(xiàng)A2、B2的P值均小于0.01，對(duì)皂苷得率的影響高度顯著，一次項(xiàng)C的P值小于0.05，對(duì)皂苷得率的影響顯著，其余項(xiàng)對(duì)皂苷得率影響不顯著。

從F值的大小可以看出，三個(gè)因素對(duì)藜麥皂苷得率的影響次序?yàn)椋贺?fù)壓>超聲溫度>超聲時(shí)間。

基于二次回歸模型，各因素間交互影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)如圖6所示。由圖6a可知，皂苷得率隨著超聲時(shí)間和超聲溫度兩因素強(qiáng)度的增大而增大，到達(dá)極值后隨著超聲時(shí)間的增大而減小；由圖6b可知，超聲時(shí)間與超聲溫度的變化等高線(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明超聲時(shí)間和超聲溫度兩因素對(duì)皂苷得率影響的交互作用顯著，且超聲溫度較超聲時(shí)間對(duì)皂苷得率影響稍大，與方差分析結(jié)果相符。由圖6c可知，皂苷得率隨著超聲時(shí)間的增大而增大，到達(dá)極值后隨著超聲時(shí)間的增大而減小，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)(0.03～0.05 MPa)皂苷得率隨著負(fù)壓的增大而增大；由圖6d可知，負(fù)壓的變化曲面比超聲時(shí)間的變化曲面陡峭，說(shuō)明負(fù)壓較超聲時(shí)間對(duì)皂苷得率影響更顯著，與方差分析結(jié)果相符。由圖6e可知，皂苷得率隨著超聲溫度的增加而增大，到達(dá)極值后隨著超聲溫度的增大而減小，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)(0.03～0.05 MPa)皂苷得率隨著負(fù)壓的增大而增大；由圖6f可知，負(fù)壓的變化曲面比超聲溫度的變化曲面陡峭，說(shuō)明負(fù)壓較超聲溫度對(duì)皂苷得率影響更顯著，與方差分析結(jié)果相符。

表4 回歸方程方差分析表Table 4 Regression equation analysis of variance table

圖6 因素交互作用對(duì)藜麥皂苷提取得率的影響Fig.6 Factors interaction effects on total saponins extraction yield from quinoa

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)響應(yīng)面分析得到超聲-負(fù)壓輔助提取法提取藜麥皂苷的最佳工藝條件為：超聲時(shí)間20 min、超聲溫度59 ℃、負(fù)壓0.065 MPa，該工藝參數(shù)下藜麥皂苷得率預(yù)測(cè)值為12.37 mg/g。該條件下重復(fù)3次平行實(shí)驗(yàn)，皂苷提取量為11.95±0.034 mg/g，與皂苷得率預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化獲得的最佳提取工藝參數(shù)可靠。

2.5 不同方法提取藜麥皂苷樣品粉末SEM表征

超聲時(shí)間20 min時(shí)，超聲溫度及負(fù)壓對(duì)藜麥細(xì)胞壁破損程度的影響結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，反光越強(qiáng)，細(xì)胞壁越完整，由此可知，不同提取條件下藜麥籽細(xì)胞的破損程度依次為：(Ⅳ)超聲溫度59 ℃、負(fù)壓0.065 MPa > (Ⅲ)超聲溫度60 ℃、負(fù)壓0.04 MPa > (Ⅱ)超聲溫度60 ℃ > (Ⅰ)超聲溫度40 ℃；其對(duì)應(yīng)的藜麥皂苷得率分別為11.95±0.034 mg/g> 11.83±0.025 mg/g > 11.82±0.027 mg/g> 10.58±0.007 mg/g。細(xì)胞破損程度越大，藜麥皂苷得率越高。

圖7 藜麥粉不同提取條件作用后的SEM圖Fig.7 SEM image of quinoa powder after different extraction conditions注：(Ⅰ)超聲溫度40 ℃；(Ⅱ)超聲溫度60 ℃；(Ⅲ)超聲溫度60 ℃，負(fù)壓0.04 MPa；(Ⅳ)超聲溫度59 ℃，負(fù)壓0.065 MPa。Note:(Ⅰ) Ultrasonic temperature is 40 ℃;(Ⅱ) Ultrasonic temperature is 60 ℃;(Ⅲ) Ultrasonic temperature is 60 ℃,negative pressure is 0.04 MPa;(Ⅳ) Ultrasonic temperature is 59 ℃,negative pressure is 0.065 MPa.

2.6 藜麥皂苷的活性測(cè)定

2.6.1 還原力的測(cè)定

藜麥皂苷總還原力結(jié)果如圖8所示。藜麥皂苷的總還原力與其濃度呈正相關(guān)，雖然藜麥皂苷較抗壞血酸的還原力差，但也具有一定的還原能力。藜麥皂苷在濃度為0.25 mg/mL時(shí)的還原能力分別是濃度為0.05 mg/mL時(shí)的6.1倍、濃度為0.10 mg/mL時(shí)的2.9倍，在實(shí)驗(yàn)的濃度范圍(0～0.25 mg/mL)內(nèi)，總還原力隨著濃度的增加而增大。

圖8 藜麥皂苷的總還原力Fig.8 Total reducing power of quinoa saponins

2.6.2 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

藜麥皂苷清除DPPH自由基能力結(jié)果由圖9所示。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)(0～0.25 mg/mL)，藜麥皂苷對(duì)DPPH自由基有清除能力與皂苷濃度呈正相關(guān)，當(dāng)濃度達(dá)到0.25 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到了(78.93±2.052)%，是濃度為0.05 mg/mL時(shí)的7.6倍、濃度為0.10 mg/mL時(shí)的4.7倍，與抗壞血酸相比略低，但也有良好的清除能力。

圖9 藜麥皂苷清除DPPH自由基的能力Fig.9 The ability of quinoa saponins to scavenge DPPH free radicals

3 結(jié)論

采用超聲-負(fù)壓輔助提取藜麥種子中的皂苷，基于單因素(超聲時(shí)間、超聲溫度和負(fù)壓)試驗(yàn)，以藜麥皂苷得率為考察指標(biāo)，考察超聲時(shí)間、超聲溫度和負(fù)壓等條件對(duì)藜麥皂苷得率的影響，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥皂苷提取工藝條件，獲得藜麥皂苷最佳提取工藝條件：超聲時(shí)間20 min、超聲溫度59 ℃、負(fù)壓0.064 MPa，該條件下藜麥皂苷提取得率(11.95±0.034 mg/g)最高，接近藜麥皂苷提取得率的預(yù)測(cè)值(12.37 mg/g)。提取三因素對(duì)藜麥皂苷得率的影響順序?yàn)椋贺?fù)壓>超聲溫度>超聲時(shí)間。經(jīng)正丁醇萃取純化后的藜麥皂苷抗氧化活性研究結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)選取的濃度范圍內(nèi)(0～0.25 mg/mL)，藜麥皂苷有較強(qiáng)的還原力和清除DPPH自由基的能力，且與其濃度呈正相關(guān)，當(dāng)濃度達(dá)到0.25 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到了(78.93±2.052)%。