吳占輝　武慧杰　周宏楊　王銳　楊青山　郭新鶴　張一然

摘要：目的 分析微小RNA-17-5p在食管鱗癌中的表達(dá)及其對食管鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響。方法 選擇實時熒光定量對ESCC組織以及細(xì)胞中miR-17-5p表達(dá)進(jìn)行檢測，采用雙熒光素酶報告實驗分析miR-17-5p與PBL2直接的相互作用，分析其在食管鱗癌細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)果 食管鱗癌組織中miR-17-5p表達(dá)水平比正常食管上皮組織高（P<0.05）。結(jié)論 食管鱗癌發(fā)生與發(fā)展過程中miR-17-5p均有參與，有望成為食管鱗癌潛在的分子治療靶點。

關(guān)鍵詞：RNA-17-5p;食管鱗癌;增殖和侵襲

微小RNA屬于內(nèi)源性非編碼RNA分子之一。每一個miRNA分子中存在的潛在靶基因數(shù)量較多，多數(shù)mRNA均具有一個被miRNA結(jié)合的進(jìn)化保守序列。相關(guān)研究得出，多個生物學(xué)過程均由miRNA的參與，與疾病進(jìn)展和發(fā)展之間關(guān)系密切，尤其是腫瘤疾病，大部分miRNA有望成為治療和評估腫瘤預(yù)后的潛在分子靶點。近些年，臨床越來越關(guān)注miR-17-5p作為癌性的miRNA分子，本次研究主要檢測食管鱗癌組織與細(xì)胞當(dāng)中miR-17-5p表達(dá)，對其相關(guān)細(xì)胞增殖和侵襲影響進(jìn)行觀察和分析。

1、材料與方法

1.1材料

（1）細(xì)胞系：食管鱗癌細(xì)胞KYSE520、KYSE70、KYSE450、TE1、Eca109以及EC9706。（2）臨床資料：選取本院2021年1月-2021年11月在本院手術(shù)當(dāng)中切除的食管鱗癌標(biāo)本53例。入選患者手術(shù)之前均未接受過放化療治療，其中男性患者數(shù)量為35例，女性患者數(shù)量為18例，平均年齡（57.24±7.68）歲。

1.2方法

（1）培養(yǎng)：在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中放置正常食管上皮細(xì)胞和食管鱗癌細(xì)胞，將其置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。（2）轉(zhuǎn)染：根據(jù)相關(guān)說明書將其轉(zhuǎn)染為TE1與EC9706細(xì)胞。（3）實時反應(yīng)：采用試劑盒提取食管鱗癌細(xì)胞和組織RNA，利用試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，檢測miR-17-5p表達(dá)水平。（4）檢測：使用細(xì)胞裂解液對TE1、EC9706細(xì)胞總蛋白進(jìn)行提取，通過相應(yīng)技術(shù)分離蛋白。（5）檢測細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染的TE1、EC9706細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，在96孔板中接種，每孔2000細(xì)胞，采用酶標(biāo)儀對吸光度（A）測定，然后采用相應(yīng)軟件繪制細(xì)胞生長曲線。（6）染色：收集細(xì)胞之后姐終于96孔板中，每孔4000細(xì)胞，按照1000：1進(jìn)行稀釋，然后在其中加入TritonX-100、甘氨酸以及細(xì)胞固定液，30min之后除去反應(yīng)液，漂洗，通過顯微鏡觀察染色結(jié)果。（7）預(yù)測靶點：利用miRDB、starBase以及TargetScan等預(yù)測軟件預(yù)測miR-17-5p可能靶基因。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用（`x±s）表示，組間比較方差用獨立樣本的t檢驗，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1miR-17-5p在ESCC細(xì)胞和組織中的表達(dá)

食管鱗癌組織中miR-17-5p表達(dá)水平比正常食管上皮組織高，比較具有顯著差異（P<0.05）。詳見表1。

3.結(jié)論

miRNA異常表達(dá)參與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，與患者生存存在非常密切的關(guān)系。在不同腫瘤當(dāng)中miRNA可能發(fā)揮抑癌基因或者癌基因功能，臨床研究中存在應(yīng)用潛力較大。相關(guān)研究得出，miR-17-5p與人乳腺癌轉(zhuǎn)移和進(jìn)展之間存在非常密切的關(guān)系，通過相關(guān)靶向信號途徑發(fā)揮相應(yīng)的作用。

miRNA作為治療制劑的最主要特點為具有靶向多于1個基因的潛能，而且特定的miRNA可能因為靶向調(diào)控基因不同所發(fā)揮的生物學(xué)功能也存在一定差異，所以需要注意調(diào)控miRNA靶向基因的意義十分重要。本次研究采用相關(guān)軟件預(yù)測靶基因，發(fā)展miR-17-5p中RBL2是一個非常重要的調(diào)控靶點，根據(jù)報告顯示轉(zhuǎn)染后其熒光素酶活性得到有效降低。除此之外，為進(jìn)一步證實miR-17-5p中RBL2是直接作用靶點，本次研究采用回復(fù)實驗，聯(lián)合應(yīng)用miR-17-5p和RBL2 siRNA抑制劑，結(jié)果得出RBL2 siRNA可部分逆轉(zhuǎn)miR-17-5p所引發(fā)的食管鱗癌細(xì)胞侵襲和增殖能力降低，得出食管鱗癌的發(fā)生和發(fā)展過程中miR-17-5p與RBL2可能共同參加。

綜上所述，在食管鱗癌細(xì)胞和組織當(dāng)中miR-17-5p呈高表達(dá)，其與食管鱗癌的TNM高分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后不良存在一定關(guān)系。miR-17-5p抑制劑顯著下調(diào)食管鱗癌細(xì)胞當(dāng)中的miR-17-5p表達(dá)，表達(dá)下調(diào)使食管鱗癌細(xì)胞侵襲和增殖能力得到顯著抑制。

參考文獻(xiàn)：

[1]陸艷榮，巴爾夏古麗·扎比胡拉，王海峰.血清微小RNA-623和微小RNA-5703及微小RNA-483-5p與局部晚期食管鱗癌患者新輔助放化療效果的關(guān)系[J].中國醫(yī)藥，2021，16（02）：245-249.

[2]許瀚，孟祥瑞，周悅，王峰.微小RNA-17-5p在食管鱗癌中的表達(dá)及其對食管鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響[J].中華腫瘤雜志，2020（02）：105-106-107-108-109-110-111-112-113.

[3]金成玲，左士宇，王曉慧，刁長英，謝藝林，李晟磊，李向楠.微小RNA-935在食管鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及其對食管鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響[J].中華實驗外科雜志，2017，34（09）：1466-1468.

項目來源于：2021年承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目（項目編號：202109A182）