劉園園，詹雯雯，繆林益，劉 軍

（新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830028）

深靜脈血栓是腫瘤疾病、外科手術(shù)后及長期臥床患者的常見并發(fā)癥，多無明顯臨床癥狀，僅10%～17%［1］的患者表現(xiàn)出下肢腫脹、局部深處觸痛和足背屈性疼痛等，如不及時(shí)干預(yù)，可能導(dǎo)致血栓相關(guān)性后遺癥，或?qū)е卵撀?，引起肺栓塞，危及患者生命?］。有研究表明，前列地爾具有明顯的抗血小板聚集及血管內(nèi)皮修復(fù)作用，并能擴(kuò)張血管、增加血流量、預(yù)防下肢血栓形成［3-4］。本研究中探討了前列地爾對深靜脈血栓模型大鼠凝血功能的調(diào)節(jié)作用及血管內(nèi)皮的保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：IX73型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；EGel Imager型凝膠成像儀（賽默飛世爾科技有限公司）；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；MyGo Pro型聚合酶鏈反應(yīng)儀（英國ITIS公司）；AMR-100型酶標(biāo)儀（杭州奧盛儀器有限公司）；RM2235型石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）；Coatron 5000型全自動(dòng)凝血分析儀（德國Teco公司）。

試藥：前列地爾注射液（北京泰德制藥股份有限公司，批號為201809121）；注射用低分子肝素鈉（意大利ArfaWassermann公司，批號為190521）；血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）兔單克隆抗體（上?？道噬锟萍加邢薰?，批號為182110）；血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、組織因子（TF）兔單克隆抗體（上海碧云天生物科技有限公司，批號分別為21303，22511）；GAPDH兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體、高效RIPA裂解液、ECL Plus超敏發(fā)光液、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（索萊寶生物科技有限公司，批號分別為17012，11251，16521，18282，17321）；大鼠血漿血栓素B2（TXB2）、組織纖溶酶原激活物（t-PA）、纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司，批號分別為14251，11291，18071）；總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、聚合酶鏈（PCR）反應(yīng)試劑盒（萬類生物科技公司，批號分別為22161，23175，24336）。

動(dòng)物：SPF級SD大鼠60只，雄性，8周齡，體質(zhì)量220～260 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK（新）2018-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號SYXK（新）2018-0003。飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～24℃，相對濕度40%～70%，晝夜交替（12 h/12 h）。

1.2 方法

將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（等體積生理鹽水灌胃）、模型組（等體積生理鹽水灌胃）、低分子肝素鈉組（360 IU/kg皮下注射）［5］及前列地爾低、中、高劑量組（2.5，5，10μg/kg腹腔注射）［6］，各10只。大鼠麻醉后取仰臥位，沿腹部正中線切開，假手術(shù)組大鼠僅開腹不進(jìn)行結(jié)扎；其余各組大鼠分離并結(jié)扎左腎靜脈下0.5 cm處下腔靜脈及左腎靜脈水平遠(yuǎn)下腔靜脈段的主要屬支，結(jié)扎完成后縫合皮膚并消毒，結(jié)扎6 h后，逐層開腹，拆線，并以下腔靜脈呈紫黑色及血栓形成視為模型復(fù)制成功，逐層縫合、消毒后給予青霉素預(yù)防感染［7-8］。建模成功后，各組大鼠給予相應(yīng)藥物或生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d［9］。

1.3 觀察指標(biāo)

血液學(xué)指標(biāo)：于大鼠眼眶靜脈叢取血，置含0.2 mL枸櫞酸鈉溶液離心管，混勻，室溫下，3 000 r/min離心10 min，取上清液，以全自動(dòng)凝血分析儀測定大鼠活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶原時(shí)間（PT）、凝血酶時(shí)間（TT）、D-二聚體（D-D）水平。大鼠麻醉后于腹主動(dòng)脈取血，置肝素潤洗過的離心管，4℃下，8 000 r/min離心10 min，取上清液，以ELISA法測定TXB2，t-PA，PAI-1水平。

血管組織病理形態(tài)學(xué)：處死大鼠，分離下腔靜脈血管組織，置中性甲醛中固定24 h，以梯度乙醇脫水處理血管組織標(biāo)本，再經(jīng)二甲苯處理后，石蠟包埋，切成4μm厚切片，用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，常規(guī)HE染色，中性樹脂固定，顯微鏡下觀察。

血管組織TM，VCAM-1，TF mRNA表達(dá)水平：采用PCR法。取大鼠下腔靜脈血管組織，勻漿，并提取總RNA，使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將血管組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)TM，VCAM-1，TF引物序列（表1），使用RT-qPCR試劑盒，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt表示各基因的相對表達(dá)量。

表1 TM，VCAM-1，TF，GAPDH引物序列Tab.1 Primer sequences of TM，VCAM-1，TF and GAPDH

血管組織TM，VCAM-1，TF蛋白表達(dá)水平：采用Western blot法。取大鼠下腔靜脈血管組織，用組織裂解液裂解并研磨，提取蛋白質(zhì)，以二喹啉甲酸法測定蛋白質(zhì)含量，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，封閉液室溫封閉2 h，經(jīng)TM，VCAM-1，TF，GAPDH兔單克隆抗體4℃孵育過夜，用TBST洗膜4次，每次5 min，以山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，用TBST洗滌5次，滴加化學(xué)發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)中成像后，以Image J 14.0軟件對各蛋白條帶進(jìn)行量化分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。結(jié)果符合正態(tài)分布且方差齊，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LS D檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APTT，PT，TT，D-D水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的APTT，PT，TT顯著縮短（P＜0.05），D-D水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各用藥組大鼠的APTT，PT，TT均顯著延長（P＜0.05），D-D水平顯著降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠APTT，PT，TT，D-D水平比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of APTT，PT，TT，D-D levels of rats in each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠APTT，PT，TT，D-D水平比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of APTT，PT，TT，D-D levels of rats in each group（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。表3、表4、圖2同。Note：Compared with those in the sham operation group，*P＜0.05（for Tab.2-4 and Fig.2）.Compared with those in model group，#P＜0.05（for Tab.2-4 and Fig.2）.

D-D（μg/L）40.51±2.33 128.64±1.94*94.06±1.78#82.23±1.48#64.71±2.23#52.29±1.91#742.117 0.01組別假手術(shù)組模型組前列地爾低劑量組前列地爾中劑量組前列地爾高劑量組低分子肝素鈉組t值P值A(chǔ)PTT（s）27.61±1.05 16.44±0.84*20.99±0.52#22.68±0.31#24.06±0.23#26.47±0.31#178.624 0.01 PT（s）12.28±0.43 7.05±0.37*8.19±0.22#9.34±0.52#10.79±0.14#11.81±0.57#140.021 0.03 TT（s）19.06±0.42 14.02±0.17*16.05±0.18#17.10±0.20#18.41±0.38#18.32±0.22#229.611 0.01

2.2 TXB2，t-PA，PAI-1水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的TXB2和PAI-1水平均顯著升高（P＜0.05），t-PA水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各用藥組大鼠的TXB2和PAI-1水平均顯著降低（P＜0.05），t-PA水平顯著升高（P＜0.05）。詳見表3。

表3 各組大鼠TXB2，t-PA，PAI-1水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of TXB2，t-PA，PAI-1 levels of rats in each group（±s，n=10）

表3 各組大鼠TXB2，t-PA，PAI-1水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of TXB2，t-PA，PAI-1 levels of rats in each group（±s，n=10）

組別假手術(shù)組模型組前列地爾低劑量組前列地爾中劑量組前列地爾高劑量組低分子肝素鈉組t值P值TXB2（pg/mL）473.19±20.38 1 368.71±34.74*873.81±24.15#792.36±23.66#642.63±35.71#509.27±18.20#634.156 0.03 t-PA（ng/mL）9.56±0.73 4.02±0.21*5.92±0.45#6.84±0.16#8.11±0.09#8.80±0.32#278.925 0.02 PAI-1（ng/mL）30.25±1.15 89.52±2.04*75.68±1.16#63.42±1.01#51.46±1.73#44.69±0.93#331.822 0.01

2.3 血管病理形態(tài)學(xué)

假手術(shù)組大鼠血管未見明顯病理形態(tài)學(xué)改變；模型組可見血栓形成，血管內(nèi)皮損傷及炎性浸潤；各用藥組血栓形成明顯減少，血管內(nèi)皮炎性浸潤程度明顯減輕。詳見圖1。

圖1 大鼠血管病理形態(tài)學(xué)（HE，×100）A.Sham operation group B.Model group C.Alprostadil low-dose group D.Alprostadil medium-dose group E.Alprostadil high-dose group F.Low molecular weight heparin sodium groupFig.1 Vascular morphopathology of rats（HE staining，×100）

2.4 TM，VCAM-1，TF mRNA表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的TM mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），VCAM-1及TF mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各用藥組大鼠的TM mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），VCAM-1及TF mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見表4。

表4 各組大鼠TM，VCAM-1，TF mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of TM，VCAM-1 and TF mRNA expression levels of rats in each group（±s，n=10）

表4 各組大鼠TM，VCAM-1，TF mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of TM，VCAM-1 and TF mRNA expression levels of rats in each group（±s，n=10）

TF 1.13±0.08 7.01±0.26*5.33±0.39#3.76±0.21#1.44±0.10#2.03±0.26#230.05 0.01組別假手術(shù)組模型組前列地爾低劑量組前列地爾中劑量組前列地爾高劑量組低分子肝素鈉組t值P值TM 5.22±0.26 0.34±0.05*1.76±0.13#3.72±0.09#5.02±0.07#4.51±0.18#183.461 0.02 VCAM-1 0.76±0.05 6.49±0.31*4.77±0.23#2.38±0.47#0.97±0.06#1.83±0.07#103.29 0.04

2.5 TM，VCAM-1，TF蛋白表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的TM蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），VCAM-1及TF蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各用藥組大鼠的TM蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），VCAM-1及TF蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見圖2。

3 討論

深靜脈血栓是由于機(jī)體血流緩慢、靜脈壁損傷和高凝狀態(tài)等致病因素導(dǎo)致的血液在深靜脈內(nèi)凝結(jié)，若不及時(shí)治療會造成血栓脫落，進(jìn)而造成肺栓塞等，危及患者生命［10］。目前臨床多采用藥物抗凝治療，但會造成凝血功能異常，增加出血風(fēng)險(xiǎn)，本身伴有出血性疾病的患者用藥需更謹(jǐn)慎。低分子肝素鈉為臨床常用抗凝藥，本研究中以此為陽性對照藥物。

前列地爾又稱前列腺素E1，具有擴(kuò)張血管及抑制血小板聚集的作用。關(guān)玉東［11］研究發(fā)現(xiàn)，前列地爾聯(lián)用血栓通能顯著改善下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥患者的臨床癥狀。林琳等［12］的研究表明，前列地爾能顯著減少中心靜脈置管患者靜脈血栓的形成。倪曉凌等［13］的研究表明，前列地爾能明顯降低脾切除和斷流術(shù)后血栓的發(fā)生率及血栓的嚴(yán)重程度。安英男等［14］研究發(fā)現(xiàn)，前列地爾能修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷，進(jìn)而發(fā)揮抗血栓作用。田立國等［15］研究發(fā)現(xiàn)，前列地爾能改善經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后患者的一氧化氮及內(nèi)皮素-1水平，改善血管內(nèi)皮功能?？梢姡傲械貭栐谝种蒲把鼙Ｗo(hù)方面潛力巨大。

圖2各組大鼠TM，VCAM-1，TF蛋白表達(dá)水平比較a.Sham operation group b.Model group c.Alprostadil low-dose group d.Alprostadil medium-dose group e.Alprostadil high-dose group f.Low molecular weight heparin sodium group A.Electrophoretogram B.Data statistics（B1.TM B2.VCAM-1 B3.TF）Fig.2 Comparison of TM，VCAM-1 and TF protein expression levels of rats in each group

APTT，PT，TT是評價(jià)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)凝血活性的關(guān)鍵指標(biāo)，三者縮短表明凝血活性增強(qiáng)［16］，t-PA由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并分泌，作為纖溶系統(tǒng)的關(guān)鍵物質(zhì)參與降解纖維蛋白和凝血因子，其水平降低則纖溶活性減弱，易導(dǎo)致血栓疾?。?7］。D-D為纖維蛋白降解產(chǎn)物之一，其水平升高表明體內(nèi)存在高凝狀態(tài)［18］；TXB2具有血小板凝聚及血管收縮作用，PAI-1作為纖溶酶原激活抑制劑，兩者水平升高提示凝血風(fēng)險(xiǎn)增加［19］。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，各用藥組大鼠的APTT，PT，TT明顯延長，t-PA水平明顯升高，D-D，TXB2，PAI-1水平均明顯降低，提示前列地爾能調(diào)節(jié)模型大鼠凝血指標(biāo)，促進(jìn)纖溶系統(tǒng)的激活，降低血栓發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

TM與凝血酶結(jié)合后可降低凝血酶的凝血活性。成曦等［20］的研究指出，TM能反映深靜脈血栓的病情進(jìn)展及預(yù)后。VCAM-1主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，能促進(jìn)白細(xì)胞聚集在血管內(nèi)皮。李彥麗等［21］的研究表明，下肢深靜脈血栓患者VCAM-1水平升高。陳娟等［22］同樣報(bào)道了VCAM-1水平與下肢深靜脈血栓患者疾病進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)，降低VCAM-1水平可改善凝血狀態(tài)（血黏度）。TF能與凝血因子Ⅶa結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)凝血級聯(lián)反應(yīng)。吳延平等［23］報(bào)道了TF參與深靜脈血栓的形成過程。陳玲［24］證實(shí)了抑制TF水平能減弱凝血酶活性，進(jìn)而抑制靜脈血栓的形成。本研究中，與模型組比較，各用藥組大鼠的TM mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高，VCAM-1及TF mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低，提示前列地爾能促進(jìn)TM基因的表達(dá)，抑制VCAM-1及TF的表達(dá)，進(jìn)而抑制血栓的形成，并保護(hù)血管內(nèi)皮的完整性。

綜上所述，前列地爾能抑制模型大鼠深靜脈血栓的形成，其機(jī)制可能與改善凝血功能、修復(fù)深靜脈血管內(nèi)皮損傷有關(guān)。