夏啟勝，鄧婷婷*，徐雅平，劉虹麟，劉浩元

0 引言

白花檵木（Loropetalum chinensis（R.Br.）Oliv）是金縷梅科檵木屬的長(zhǎng)青灌木植物，始載于《植物名實(shí)圖考》，因具有清熱解毒、通經(jīng)活絡(luò)等功效，很早以前就作為藥用植物在民間使用[1]。近年來(lái)對(duì)其化合物的分離和藥用活性成分鑒定發(fā)現(xiàn)，白花檵木含有揮發(fā)油、鞣質(zhì)、黃酮、木脂素類(lèi)等多種具有藥理活性的次生代謝物[2-3]。目前研究集中在治療創(chuàng)傷出血及促傷口愈合方面[4-5]。因白花檵木含有黃酮類(lèi)化合物，推測(cè)其可能具有一定的抗腫瘤作用，但目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究以白花檵木粗提物為研究對(duì)象、人肺腺癌細(xì)胞A549作為研究模型，探討白花檵木體外抑制肺腺癌細(xì)胞增殖的功效，為更好地開(kāi)發(fā)利用白花檵木資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人肺癌A549細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

白花檵木粗提物，為白花檵木葉子醇提物，棕色粉末，由北京白花檵木有限公司提供（批號(hào)20190516）。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。Annexin V-APC、PI流式細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。兔抗人Caspase-3抗體（貨號(hào)：19677-1-AP）、鼠抗人GAPDH抗體（貨號(hào)：HRP-60004）和兔抗人Bax抗體（貨號(hào)：50599-2-Ig）均購(gòu)自中國(guó)Proteintech公司；兔抗人Bcl-2（貨號(hào)：CAS7511）購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司；兔抗人Fas抗體（貨號(hào)：ab133619）、山羊抗兔IgG二抗抗體（貨號(hào)：ab6721）和兔抗小鼠IgG二抗抗體（貨號(hào)：ab6728）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。0.22 μm PVDF膜（貨號(hào)：ISEQ00010）、DMSO（D2650）均購(gòu)自德國(guó)Merck公司。

1.3 儀器

BD CantoⅡ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。Western blot電泳儀和ChemiDoc成像儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1 試劑配制 稱(chēng)取0.5 g白花檵木粗提物溶于2 ml DMSO，配制濃度為0.25 g/ml的儲(chǔ)存液，經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾，得到250 mg/ml的無(wú)菌儲(chǔ)存液。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合至瓶底面積80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。細(xì)胞傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)基，D-Hanks洗細(xì)胞2次，0.1%胰蛋白酶-0.1%EDTA消化細(xì)胞。隨后加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，離心收集細(xì)胞。以新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞傳至3個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，加入適量DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，胰酶消化制備細(xì)胞懸液，隨后按2×104細(xì)胞/孔的濃度將細(xì)胞接種于96孔板，24 h后加入白花檵木粗提物進(jìn)行后續(xù)處理。實(shí)驗(yàn)共設(shè)6組：1.25、1、0.75、0.5、0.25 mg/ml白花檵木粗提物處理組和溶媒對(duì)照組（僅含5‰DMSO，不含白花檵木），及不含細(xì)胞僅有等體積DMSO完全培養(yǎng)基的空白對(duì)照組，以排除培養(yǎng)基干擾。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)：24、48和72 h，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。白花檵木粗提物處理24、48和72 h后，每孔加入10 μl的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下各孔的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4.4 集落形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，胰酶消化制備細(xì)胞懸液，隨后按2×102個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔板，待24 h細(xì)胞貼壁后，分別給予不同濃度的白花檵木粗提物并連續(xù)作用14天，白花檵木粗提物的濃度為0、10、20和40 μg/ml，其中0 μg/ml為對(duì)照組。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，待培養(yǎng)結(jié)束后2.5%結(jié)晶紫染色，計(jì)算集落個(gè)數(shù)。

1.4.5 Annexin V-APC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，按照2×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔板，接種24 h后加入白花檵木粗提物。實(shí)驗(yàn)共設(shè)4組，白花檵木粗提物濃度分別為0、0.25、0.5和1 mg/ml，其中0 mg/ml為對(duì)照組。處理24 h后收集細(xì)胞，以不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Annexin V-APC/PI染色，隨后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.4.6 Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 用0、0.25、0.5和1 mg/ml白花檵木粗提物處理A549細(xì)胞24 h后提取細(xì)胞總蛋白，其中0 mg/ml為對(duì)照組。100℃加熱10 min，蛋白變性后，立即進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，PVDF膜以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，隨后分別加入Bax（1:1 000 稀釋?zhuān)cl-2 (1:1 000稀釋?zhuān)?、Fas（1:1 000稀釋?zhuān)?、活性Caspase3（1:1 000稀釋?zhuān)?、GAPDH（1:10 000稀釋?zhuān)┮豢梗?℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗4次，隨后加入HRP標(biāo)記的二抗（1:20 000稀釋?zhuān)?，室溫?fù)u床上孵育2 h，TBST洗4次。根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配置發(fā)光液，以Bio-Rad成像儀進(jìn)行條帶顯色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白花檵木粗提物對(duì)A549肺癌細(xì)胞增殖的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白花檵木粗提物對(duì)A549細(xì)胞增殖具有抑制作用，作用24、48和72 h后的IC50值分別為1.12、0.48和0.36 mg/ml。隨著白花檵木粗提物濃度的增加，抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，除0.25 mg/ml白花檵木粗提物組外，其余濃度24、48、72 h組與溶媒對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）。隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)（P<0.001），見(jiàn)圖1。

2.2 白花檵木粗提物對(duì)A549肺癌細(xì)胞集落形成的影響

集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)14天的集落培養(yǎng)，白花檵木粗提物呈濃度依賴(lài)性地抑制A549細(xì)胞的集落形成能力。40 μg/ml白花檵木粗提物處理組作用14天未見(jiàn)到任何集落形成，見(jiàn)圖2。

2.3 白花檵木粗提物對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的白花檵木粗提物處理A549細(xì)胞24 h后細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的凋亡，用0.25、0.5和1 mg/ml的白花檵木粗提物處理后，早期凋亡細(xì)胞的比例分別為19.50%、38.90%和55.40%，晚期凋亡細(xì)胞的比例分別為2.07%、7.52%和18.50%，早、晚期凋亡率均隨藥物濃度依次遞增，見(jiàn)圖3。

2.4 白花檵木對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，不同濃度白花檵木粗提物處理A549細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組（0 μg/ml）相比，各濃度處理組A549細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax、Fas及活性Caspase3蛋白表達(dá)水平升高，見(jiàn)圖4。提示白花檵木粗提物可能通過(guò)同時(shí)激活線(xiàn)粒體和死亡受體通路促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡。

3 討論

天然產(chǎn)物是人類(lèi)藥物研發(fā)的寶庫(kù)，很多植物來(lái)源的天然產(chǎn)物具有抗癌作用已有較多報(bào)道[6-7]，已有研究顯示白花檵木含有多種具有抗癌活性的物質(zhì)，如：檞皮素、沒(méi)食子酸等[8]，提示白花檵木可能具有一定的抗癌作用。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)白花檵木粗提物的抗癌作用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示白花檵木粗提物可以顯著抑制人A549肺癌細(xì)胞的增殖，并且呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)性；同時(shí)，提示白花檵木粗提物能夠抑制A549細(xì)胞的集落形成能力，并且呈濃度依賴(lài)性，作用時(shí)間較短的時(shí)候抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)需要的白花檵木粗提物濃度稍高一些，0.5 mg/ml的藥物作用48 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)率下降50%。但當(dāng)藥物處理14天時(shí)，僅非常低的濃度，如40 μg/ml的濃度就可以完全抑制A549細(xì)胞集落形成。這些結(jié)果均證實(shí)白花檵木粗提物對(duì)人肺腺癌細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，并且作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制效果越好。

為進(jìn)一步了解白花檵木粗提物抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖的可能機(jī)制，我們進(jìn)行了流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)和凋亡相關(guān)蛋白免疫印跡檢測(cè)。細(xì)胞凋亡在分子水平受多種凋亡相關(guān)基因/基因產(chǎn)物調(diào)控。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡主要有兩條調(diào)節(jié)途徑[9]：線(xiàn)粒體通路及細(xì)胞表面死亡受體通路。前者主要由促凋亡蛋白（如：Bax）和抗凋亡蛋白（如：Bcl-2）共同參與調(diào)控細(xì)胞程序性死亡。二者的比例決定細(xì)胞在收到凋亡信號(hào)時(shí)是否發(fā)生凋亡，也被作為評(píng)判腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物敏感或耐受的指標(biāo)。后者主要是Fas/FasL途徑。由這些細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)與攜帶凋亡信號(hào)的特異性配體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。半胱氨酸天門(mén)冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase）家族在細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是多條凋亡通路的匯聚點(diǎn)，尤其是其中的Caspase3[10-12]。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)白花檵木粗提物處理A549細(xì)胞24 h后細(xì)胞就開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的凋亡，且凋亡率呈劑量依賴(lài)性，說(shuō)明白花檵木粗提物可能通過(guò)激活凋亡通路抑制肺腺癌細(xì)胞增殖，但還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證，其機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。

在蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)一步檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Fas、Caspase3及活性Caspase3在白花檵木粗提物作用A549細(xì)胞后的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著白花檵木粗提物濃度的增加，促凋亡基因Bax表達(dá)上調(diào)，而凋亡抑制基因Bcl-2表達(dá)減弱，且Bax/Bcl-2的比例也逐漸增加。此外，F(xiàn)as、活性Caspase3的表達(dá)也隨白花檵木粗提物濃度的增加而上調(diào)。以上結(jié)果提示：白花檵木粗提物的抗癌機(jī)制可能與同時(shí)激活線(xiàn)粒體和死亡受體凋亡通路有關(guān)?？紤]到本實(shí)驗(yàn)中用的是粗提物，產(chǎn)物中的成分相對(duì)較多，作用機(jī)制也比較復(fù)雜，激活線(xiàn)粒體通路和凋亡通路可能是由不同提取物成分引起的，但這一推測(cè)還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，還將進(jìn)一步了解白花檵木粗提物中的關(guān)鍵有效成分，明確是哪些成分起到的抗癌作用，為新藥研發(fā)積累數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

總之，本研究首次報(bào)道了白花檵木粗提物在肺癌細(xì)胞中的體外抗癌作用，并對(duì)其抗癌作用的量效關(guān)系和作用機(jī)制進(jìn)行了初步的研究，結(jié)果顯示白花檵木粗提物對(duì)于肺腺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，其機(jī)制可能通過(guò)激活線(xiàn)粒體及死亡受體信號(hào)通路激活凋亡，抑制A549細(xì)胞增殖。提示白花檵木粗提物在肺癌的治療中有一定的應(yīng)用前景，后續(xù)可以進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，明確該粗提物在小鼠體內(nèi)的安全性和有效性。