靳鑫，王蘇蒙，祁慶生，梁泉峰

山東大學微生物技術(shù)國家重點實驗室，山東 青島 266237

L-異亮氨酸是人體8 種必需氨基酸之一，屬于三大支鏈氨基酸。在人體生命活動中具有重要作用，因此廣泛用于食品、藥品、保健品、化妝品等領(lǐng)域[1-4]。目前生產(chǎn)L-異亮氨酸方法主要包括蛋白提取、化學合成、酶合成和微生物發(fā)酵[5-6]。其中微生物發(fā)酵法是工業(yè)生產(chǎn)L-異亮氨酸的主流方法，生產(chǎn)菌株主要包括大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌和乳酸發(fā)酵短桿菌。相比大腸桿菌，谷氨酸棒桿菌屬于食品安全級微生物（generally recognized as safe，GRAS）[7-8]，產(chǎn)物只有一種同分異構(gòu)體，且不含有內(nèi)毒素，具有非致病性，安全性較高，表明谷氨酸棒桿菌是生產(chǎn)食品藥品級發(fā)酵產(chǎn)品的理想菌株[9]。谷氨酸棒桿菌作為L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株，在氨基酸后期提取等方面優(yōu)勢明顯。

L-異亮氨酸通過微生物生產(chǎn)過程中，由于L-異亮氨酸較長的代謝合成途徑以及復雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使得通過理性的代謝工程手段改造模式菌株，構(gòu)建L-異亮氨酸優(yōu)勢生產(chǎn)菌較為困難。因此，主流構(gòu)建高產(chǎn)菌的策略是通過隨機誘變野生型菌株，然后篩選具有高產(chǎn)L-異亮氨酸潛力的誘變菌株[10]，再通過理性的代謝工程策略與手段進一步改造，獲得能夠應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的高經(jīng)濟效益和高產(chǎn)量的L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株[11]。但傳統(tǒng)誘變育種存在篩選通量大、周期長和后期提取復雜等問題，并且經(jīng)過傳統(tǒng)誘變后的菌株基因組上很可能引入了有害突變，造成生產(chǎn)菌株遺傳背景不清楚[12]，導致菌株在進行下一階段代謝工程改造過程中遺傳操作困難。實驗室改造過程中菌株生長緩慢，且復雜有機酸較多，增加了理性改造獲得高轉(zhuǎn)化率菌株的難度。谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)異亮氨酸的策略主要有過表達生物合成途徑的關(guān)鍵基因、胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運、解除異亮氨酸對蘇氨酸脫水酶和乙酰羥基酸合酶的反饋抑制。研究表明，全局調(diào)控基因?qū)Ξ惲涟彼岷铣赏緩疥P(guān)鍵基因具有統(tǒng)籌作用，因此全局調(diào)控因子的表達調(diào)控對異亮氨酸的生產(chǎn)具有重要作用。

相比于大腸桿菌等工業(yè)微生物，能夠應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌的遺傳操作工具，尤其是在基因組水平編輯的工具較少[13]。因此，從基因組水平上進行單核苷酸突變、基因大片段敲除和插入以及進行基因表達水平調(diào)控和外源基因的整合是構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的基礎(chǔ)。而外源基因穩(wěn)定表達工業(yè)菌的策略是目前解決這些問題的理想方法，因此許多研究人員致力于開發(fā)更高效的基因整合技術(shù)[14]。本文綜述了廣泛應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌基因組整合使用的遺傳操作手段，包括同源重組以及較成熟應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌依賴于重組酶的定點整合系統(tǒng)，以期為工業(yè)水平穩(wěn)定生產(chǎn)L-異亮氨酸高產(chǎn)菌株的基因整合策略提供參考依據(jù)。

1 L-異亮氨酸的生物合成途徑與代謝調(diào)控

1.1 L-異亮氨酸的生物合成途徑

L-異亮氨酸在谷氨酸棒桿菌的生物合成途徑較長，且與其他氨基酸代謝合成途徑有重合部分，如蘇氨酸、賴氨酸等[15]。谷氨酸棒桿菌以葡萄糖為底物，經(jīng)過糖酵解途徑（embden-meyerhof-parnas pathway，EMP）、戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway，PPP）以及三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）等中心代謝途徑一系列酶催化后生成草酰乙酸，隨后在轉(zhuǎn)氨酶作用下生成L-天冬氨酸，經(jīng)過包括5個限速酶在內(nèi)的10步酶催化反應(yīng)，具體生物合成途徑如圖1所示，最后通過brnFE編碼的支鏈氨基酸胞外轉(zhuǎn)運蛋白將合成的L-異亮氨酸運出胞外。

1.2 L-異亮氨酸的代謝調(diào)控

葡萄糖進入胞內(nèi)，經(jīng)過L-異亮氨酸生物合成途徑合成L-天冬氨酸。L-天冬氨酸首先經(jīng)過天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）、天冬氨酸半醛脫氫酶（aspartyl semialdehyde dehydrogenase，ASD）、高絲氨酸脫氫酶（homoserine dehydrogenase，HD）、高絲氨酸激酶（homoserine kinase，HK）和蘇氨酸合酶（threonine synthase，TS）催化，并分別由lysc、asd、hom、thrB和thrC基因編碼生成蘇氨酸；然后經(jīng)過由蘇氨酸脫水酶（threonine dehydrogenase，TD）、乙酰羥基酸合酶（acetohydroxy acid synthase，AHAS）、乙酰羧基酸合成酶（ketol-acid reductoisomerase，AHAIR）、二羥酸還原異構(gòu)酶（dihydroxy-acid dehydratase，DHAD)和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（branched-chain-amino-acid aminotransferase，TA）催化合成L-異亮氨酸，并分別由ilvA、ilvBN、ilvC、ilvD和ilvE編碼。L-異亮氨酸的代謝途徑有5個關(guān)鍵節(jié)點，分別由天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸脫水酶和乙酰羥基酸合成酶5 個關(guān)鍵酶催化。其中天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶和高絲氨酸激酶受到蘇氨酸反饋抑制；蘇氨酸脫水酶和乙酰羥基酸合成酶受到異亮氨酸的反饋抑制。但在L-蘇氨酸到L-異亮氨酸的代謝途徑中，酶同樣催化L-亮氨酸和L-纈氨酸的生物合成，且乙酰羥基酸合成酶也受到L-亮氨酸和L-纈氨酸的反饋抑制，表明L-異亮氨酸合成過程中代謝調(diào)控具有復雜性，具體代謝調(diào)控機制如圖1所示。

圖1 谷氨酸棒桿菌中L-異亮氨酸的生物合成途徑及代謝調(diào)控機制Fig.1 Biosynthetic pathway and metabolic regulation mechanism of L-isoleucine in Corynebacterium glutamicum

草酰乙酸轉(zhuǎn)氨形成L-天冬氨酸后，從L-天冬氨酸合成L-蘇氨酸這部分代謝途徑中受到3 個關(guān)鍵酶的催化，同時也是這部分代謝途徑的限速步驟，分別是天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶和高絲氨酸激酶。其中天冬氨酸激酶是L-天冬氨酸到L-異亮氨酸生物合成途徑的第一個關(guān)鍵節(jié)點，催化天冬氨酸到天冬氨酸半醛，催化過程需要消耗ATP，同時該酶也受到L-賴氨酸的反饋抑制[16]；高絲氨酸脫氫酶以NADPH 為還原力將天冬氨酸-β-半醛脫羧催化為L-高絲氨酸，在對蘇氨酸的反饋抑制中以變構(gòu)非競爭性方式被抑制；高絲氨酸激酶與高絲氨酸脫氫酶不同，其通過競爭性抑制機制被抑制[17]，將L-高絲氨酸催化成為高絲氨酸磷酸。

L-蘇氨酸到L-異亮氨酸合成代謝途徑中受到2 個關(guān)鍵酶的催化，分別是蘇氨酸脫水酶和乙酰羥基酸合成酶，這2 個酶催化的反應(yīng)不但受到L-異亮氨酸的反饋抑制[18]，進而抑制TD 和AHAS的活性，且TD 催化蘇氨酸脫水形成2-酮丁酸，AHAS對2-酮丁酸的親和力大于丙酮酸，2-酮丁酸存在時傾向于合成L-異亮氨酸[19]，因此蘇氨酸脫水酶催化形成的2-酮丁酸是下一步乙酰羥基酸合成酶催化形成L-異亮氨酸的重要前體；同時AHAS 不但催化1 分子丙酮酸和1 分子酮酸形成異亮氨酸的前體乙酰羥基丁酸[20]，而且催化2 分子丙酮酸脫羧形成L-纈氨酸和L-亮氨酸的前體2-乙酰乳酸。因此蘇氨酸脫水酶和乙酰羥基酸合成酶在L-異亮氨酸合成過程中不但是限速步驟，而且決定了最終節(jié)點處的代謝流向。

2 L-異亮氨酸的生產(chǎn)策略

如圖2 所示，根據(jù)L-異亮氨酸的生物合成途徑和代謝調(diào)控，生產(chǎn)L-異亮氨酸的策略主要為：①解除反饋抑制；②過表達L-異亮氨酸合成途徑關(guān)鍵基因；③修飾轉(zhuǎn)運系統(tǒng)；④輔助因子平衡。

圖2 谷氨酸棒桿菌中L-異亮氨酸的改造策略Fig.2 Transformation strategy of L-isoleucine in Corynebacterium glutamicum

2.1 解除反饋抑制

L-異亮氨酸合成過程中由于受到自身的反饋抑制，不但削弱了L-異亮氨酸代謝途徑前體的積累，而且導致僅通過過表達基因等增強L-異亮氨酸代謝流強度這一常規(guī)代謝工程手段不適用于L-異亮氨酸這種合成途徑較長，同時受到多級調(diào)控和反饋阻遏的產(chǎn)物。因此通過隨機誘變篩選或者定向誘變得到的解除反饋抑制的酶催化作用下能顯著提高L-異亮氨酸的產(chǎn)量，對于隨機誘變的生產(chǎn)菌株，在進行理性代謝工程改造時可以通過引入解除反饋抑制的突變位點，進而解除L-異亮氨酸對關(guān)鍵節(jié)點酶的反饋抑制，最終顯著提高了氨基酸產(chǎn)量。

2.1.1 解除L-蘇氨酸反饋抑制 L-異亮氨酸生物合成途徑不僅包括L-蘇氨酸合成途徑，也包括L-蘇氨酸對天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶和高絲氨酸激酶的反饋抑制，通過構(gòu)建這3 個關(guān)鍵酶的突變體或者通過對隨機誘變得到的高產(chǎn)菌株中編碼酶的突變基因進行挖掘，能夠得到解除L-蘇氨酸反饋抑制的酶突變體，增強L-異亮氨酸合成通路的代謝流。

L-蘇氨酸、L-賴氨酸和L-異亮氨酸是天冬氨酸的下游產(chǎn)物，天冬氨酸激酶是天冬氨酸合成L-異亮氨酸的第一個關(guān)鍵酶，L-賴氨酸是天冬氨酸-β-半醛的下游氨基酸，對天冬氨酸激酶有反饋抑制。通過構(gòu)建天冬氨酸激酶突變體，不僅能不同程度地分別解除L-蘇氨酸的反饋抑制，如lysCN374T、lysCE278V和lysCD274A等[21-22]，如lysCS381F能夠解除L-賴氨酸的反饋抑制[23]，有些突變體如lysCT31I和lysCA279T能夠解除L-蘇氨酸和L-賴氨酸的協(xié)同反饋抑制[24-25]；高絲氨酸脫氫酶中第378 位突變是解除反饋抑制的重要位點，homG378E和homG378S突變體不同程度解除了L-蘇氨酸反饋抑制[25-26]；高絲氨酸激酶突變體thrBA20G不但保留了野生酶活性，同時顯著降低了L-蘇氨酸對該酶的反饋抑制作用[27]（表1）。

表1 L-異亮氨酸生物合成途徑解除反饋抑制位點Table 1 Feedback inhibition sites of L-isoleucine biosynthesis pathway

2.1.2 解除L-異亮氨酸反饋抑制 從L-蘇氨酸到L-異亮氨酸生物合成過程中，蘇氨酸脫水酶和乙酰羥基酸合成酶不但是L-異亮氨酸合成的限速步驟，而且對L-異亮氨酸前體合成以及代謝流向具有決定作用，通過引入解除L-異亮氨酸反饋抑制的關(guān)鍵酶，能使代謝流更多流向L-異亮氨酸合成。

蘇氨酸脫水酶是L-蘇氨酸到L-異亮氨酸代謝途徑的第一個關(guān)鍵酶，催化L-蘇氨酸脫水形成2-酮丁酸，同時乙酰羥基酸合成酶對2-酮丁酸的親和力大于丙酮酸，2-酮丁酸存在時傾向于合成L-異亮氨酸[19]，因此蘇氨酸脫水酶和乙酰羥基酸合成酶共同決定了生成的支鏈氨基酸種類。解除L-異亮氨酸對蘇氨酸脫水酶和支鏈氨基酸對乙酰羥基酸合成酶的反饋抑制對于L-異亮氨酸的積累具有重要意義，因此通過引入解除反饋抑制的突變位點可提高L-異亮氨酸的產(chǎn)量。蘇氨酸脫水酶突變體ilvAV323A和ilvAH278R-L351S解除了L-異亮氨酸對蘇氨酸脫水酶的反饋抑制[28]；ilvAV140M相比于野生型，蘇氨酸脫水酶活性提高了1.5倍，ilvAF383A完全解除了反饋抑制，雙突變體ilvAV140M-F383V不但酶活提高了1.5倍，并且完全解除了L-異亮氨酸的反饋抑制[18]。乙酰羥基酸合成酶調(diào)節(jié)亞基上G20D-I21D-I22F 突變解除了L-纈氨酸、L-異亮氨酸和L-亮氨酸的反饋抑制[29]；Pro176Ser、Asp426Glu和Leu575Trp突變后不再受L-異亮氨酸的反饋抑制，L-異亮氨酸的產(chǎn)量有所提高。有研究通過將蘇氨酸脫水酶突變體ilvAF383V和乙酰羥基酸合成酶大亞基突變體ilvBNP176S-D426E-L575W共表達后搖瓶發(fā)酵，72 h后L-異亮氨酸的產(chǎn)量為30.7 g·L-1，產(chǎn)量提高了131.7%[30]（表1）。

2.2 過表達代謝途徑關(guān)鍵基因

通過組合過表達L-異亮氨酸合成途徑關(guān)鍵基因，主要包括編碼5 個重要節(jié)點酶、NADPH 的供給相關(guān)酶和L-異亮氨酸胞外轉(zhuǎn)運蛋白的基因，其中過表達5 個重要節(jié)點酶最主要的是解除L-蘇氨酸和L-異亮氨酸反饋抑制的突變體基因，從而加強L-異亮氨酸主代謝流，提高L-異亮氨酸產(chǎn)量。

有研究將ilvBN、ppnK、lrp和brnFE進行不同組合過表達，其中WM005/pYCW-1-ilvBN2-ppnK1在72 h 分批補料發(fā)酵后生產(chǎn)32.1 g·L-1的L-異亮氨酸，較對照菌株提高了34.3%[31]；fusA編碼的核糖體延伸因子G 促進細菌蛋白質(zhì)合成的易位步驟，frr編碼的核糖體循環(huán)因子與延伸因子G 共同在翻譯終止后將核糖體從信使RNA 中解離，fusA和frr的過表達能夠提高谷氨酸棒桿菌IWJ001 中L-異亮氨酸產(chǎn)量，usA和frr以及ilvA、ilvB、ilvN和ppnk基因共同過表達后，L-異亮氨酸產(chǎn)量增加76.5%，并在72 h 補料分批發(fā)酵中產(chǎn)生了28.5 g·L-1L-異亮氨酸[32]。

研究表明，除了對谷氨酸棒桿菌胞內(nèi)L-異亮氨酸合成途徑關(guān)鍵酶的過表達，在谷氨酸棒桿菌中過表達大腸桿菌thrABC基因（編碼雙功能的天冬氨酸激酶Ⅰ-高絲氨酸脫氫酶Ⅰ、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合成酶），同時敲除alaT（編碼丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶），經(jīng)過組合這兩種改造策略的菌株YILWΔalaT比出發(fā)菌株L-異亮氨酸產(chǎn)量提高了17.6%，同時減少了其他副產(chǎn)物氨基酸的積累量，使碳代謝流向L-異亮氨酸生物合成[33]。

2.3 修飾轉(zhuǎn)運系統(tǒng)

由brnF和brnE雙組分編碼的支鏈氨基酸胞外轉(zhuǎn)運蛋白能夠非特異性向胞外轉(zhuǎn)運支鏈氨基酸（L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸）和蛋氨酸，并且受到全局調(diào)控因子lrp的調(diào)節(jié)[34]。brnFE編碼的胞外轉(zhuǎn)運能夠減輕胞內(nèi)L-異亮氨酸的濃度，減輕合成途徑中關(guān)鍵節(jié)點的反饋抑制，從而增加L-異亮氨酸的生物合成[35]。brnQ編碼支鏈氨基酸向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的蛋白。支鏈氨基酸的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運是由Na+介導[36-37]、質(zhì)子驅(qū)動的[38]。brnFE的過表達提高了L-異亮氨酸的胞外轉(zhuǎn)運效率，brnQ的敲除降低了谷氨酸棒桿菌對胞外L-異亮氨酸的攝取，L-異亮氨酸的凈排放量是L-異亮氨酸高產(chǎn)量的重要因素[39]。

谷氨酸棒桿菌中編碼支鏈氨基酸胞外轉(zhuǎn)運蛋白基因brnFE的上調(diào)提高了包括L-異亮氨酸在內(nèi)的多種氨基酸的高效生物合成[40-41]。當胞內(nèi)支鏈氨基酸和蛋氨酸積累時，lrp能夠結(jié)合到lrp與brnF之間的基因區(qū)域，保證LRP 在其底物氨基酸積累時才合成[9]，進而激活brnFE的表達[42-43]。研究表明lrp、brnFE和lrp-brnFE分別在谷氨酸棒桿菌L-異亮氨酸生產(chǎn)菌中過表達，過表達lrp比過表達brnFE能產(chǎn)生更多的L-異亮氨酸，共同過表達時產(chǎn)量與對照菌相比顯著增加，JHI3-156/pDXW-8-lrp-brnFE在搖瓶發(fā)酵和分批補料培養(yǎng)條件下L-異亮氨酸產(chǎn)量分別提高了63%和72%[34]。

敲除brnQ基因能夠阻斷谷氨酸棒桿菌對胞外L-異亮氨酸的攝取，提高L-異亮氨酸的產(chǎn)量[31]。有研究通過降低谷氨酸棒桿菌L-異亮氨酸向胞內(nèi)攝取和提高L-異亮氨酸向胞外轉(zhuǎn)運，并構(gòu)建了YILWΔbrnQ、YILWpXMJ19brnFE和YILWΔbrnQ/pXMJ19brnFE，結(jié)果表明，與出發(fā)菌株相比，L-異亮氨酸外排率均提高，L-異亮氨酸產(chǎn)量分別提高了10.4%、28.2%和43.6%[39]。以上研究表明將降低攝取提高轉(zhuǎn)運這一策略應(yīng)用于理性改造工業(yè)水平的發(fā)酵菌株，可提高產(chǎn)量和經(jīng)濟效益。

2.4 輔助因子平衡

NADPH/NADP+影響了細胞內(nèi)碳流分配和酶催化活性，因此，NADPH 的再生能夠維持細胞內(nèi)依賴NADPH 的代謝活動與酶催化過程。同時代謝工程改造氨基酸高產(chǎn)菌株的關(guān)鍵在于改善胞內(nèi)NADPH 的供應(yīng)。因此，通過選擇合適的NADPH再生策略能夠使碳代謝流最大化流向目標氨基酸。此外，工業(yè)菌株可能在生長、生產(chǎn)等發(fā)酵階段需要不同的輔因子水平。如將來自糖酵解的碳通量引入磷酸戊糖途徑以增加NADPH 含量有利于目標代謝產(chǎn)物的生成。來自谷氨酸棒桿菌ATCC 13032 的ASD 是一種依賴于NADPH 的酶，需要大量NADPH 才能進行高水平賴氨酸生物合成，NADPH/NADP+的不平衡導致菌株生長狀況差，目標產(chǎn)物水平降低[44-45]。

2.4.1 提高NADPH/NADP+的比率 提高NADPH/NADP+的比率主要通過兩種策略實現(xiàn)，一種是通過戊糖磷酸途徑中基因編碼的酶催化作用下將NADP+還原為NADPH；另一種是通過表達編碼NAD+激酶的ppnK基因（磷酸化NADH 產(chǎn)生NADPH）。谷氨酸棒桿菌中通過過表達與戊糖磷酸途徑（PPP 途徑）相關(guān)的基因，包括gnd、fbp和pgl，經(jīng)過分別過表達和組合表達這3個基因，相比于對照菌株，胞內(nèi)NADPH/NADH+比率提高了3～4 倍，并且生物量和轉(zhuǎn)化率均有明顯的提高，其中IWJ001/pDXW-8-gnd-fbp和IWJ001/pDXW-8-gndfbp-pgl相比于對照菌株L-異亮氨酸，產(chǎn)量分別提高了38.4%和65.1%。表明將碳通量引向戊糖磷酸途徑能夠增加NADPH 的供應(yīng)，提高胞內(nèi)NADPH/NADH+比率，進而增加L-異亮氨酸的產(chǎn)量[46]。研究發(fā)現(xiàn)，增強zwf、gnd、ppnK、pntAB和udhA基因表達均能提高異亮氨酸的濃度，過表達編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因表現(xiàn)最好，NADPH 和NADPH/NADH+比率分別提高了61.24%和90.63%[47]。將谷氨酸棒桿菌編碼NAD+激酶的ppnK基因（磷酸化NAD+產(chǎn)生NADP+）、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因和來自釀酒酵母編碼NADH 激酶的Pos5基因分別過表達，以及zwf-ppnK的共同過表達，均增加了胞內(nèi)NADPH/NADH+比率和最終L-異亮氨酸的產(chǎn)量。其中zwf-ppnK的共同過表達顯著提高了NADPH/NADH+比率，并且使L-異亮氨酸的產(chǎn)量提高了85.9%[48]。

2.4.2 NADPH 再生 構(gòu)建低成本和高效的NADPH 再生系統(tǒng)不但能保持胞內(nèi)氧化還原平衡，并且可改善依賴NADPH 產(chǎn)物的產(chǎn)量。NAD+可以通過NAD+激酶轉(zhuǎn)換為NADP+[49]，膜連接轉(zhuǎn)氫酶（membrane-linked hydrogenase，PntAB）或可溶性轉(zhuǎn)氫酶（soluble transhydrogenase，UdhA）可以催化NADH 向NADPH 的轉(zhuǎn)化[50]，增加轉(zhuǎn)氫酶的活性，并將多余的NADH 轉(zhuǎn)化為NADPH。通過將來自大腸桿菌JM109 菌株中編碼pntAB基因和谷氨酸棒桿菌編碼NAD+激酶的ppnK基因（催化NADP+到NADPH）共同過表達，顯著提高了精氨酸的產(chǎn)量；在大腸桿菌生產(chǎn)木糖醇[51]和3-羥丙酸[52]的研究中，PntAB 增加了兩種產(chǎn)物的產(chǎn)量，并且L-異亮氨酸的生產(chǎn)需要更多NADPH[53]。同時也有研究表明NAD+激酶的過表達對異丁醇的生產(chǎn)無顯著影響，但NAD+激酶和轉(zhuǎn)氫酶PntAB 的組合會導致異丁醇產(chǎn)量提高，進一步表明轉(zhuǎn)氫酶和NAD+激酶對增加NADPH供應(yīng)有協(xié)同效應(yīng)[54]。

2.4.3 引入外源依賴NADH的酶 天冬氨酸脫氫酶和天冬氨酸-β-半醛脫氫酶是L-天冬氨酸通路中利用NADPH 的酶，通過在谷氨酸棒桿菌中引入外源依賴NADH 的酶，或者通過突變酶結(jié)合中心關(guān)鍵殘基改變酶的輔因子偏好從而利用NADH，提高了NADPH/NADH比率，緩解了NADPH供應(yīng)壓力。

引入外源依賴NADH的酶可提高谷氨酸棒桿菌L-賴氨酸產(chǎn)量，已知合成1 mol L-賴氨酸需要4 mol 的NADPH，因此，在L-賴氨酸合成途徑引入中直接利用NADH 的酶，有利于L-賴氨酸生產(chǎn)過程中輔助因子平衡。利用酶挖掘技術(shù)已經(jīng)鑒定了一系列利用脫氫酶的NADH，分別為來自銅綠假單胞菌的天冬氨酸脫氫酶（Pseudomonas aeruginosaaspartate dehydrogenase，PaASPDH）、來自運動替斯崔納菌的天冬氨酸-β-半醛脫氫酶（Tistrella mobilisaspartate-β-semialdehyde dehydrogenase，TmASADH)、來自大腸桿菌的二氫二癸酸還原酶（Escherichia colidihydrodipicolinate reductase，EcDHDPR）和來自假熱熱孢菌的二氨基庚二酸脫氫酶（Pseudothermotoga thermarumdiaminopimelate dehydrogenase，PtDAPDH）。過 表 達PaASPDH、TmASADH、EcDHDPR 和PtDAPDH 使賴氨酸的產(chǎn)生分別增加了30.7%、32.4%、17.4% 和36.8%。PaASPDH、TmASADH 和EcDHDPR 的組合表達菌株中L-賴氨酸產(chǎn)量最高增加30.7%，過表達4 種NADH 利用酶可以提高L-賴氨酸產(chǎn)量，同時不依賴氧化戊糖磷酸途徑提供NADPH[55]。

通過對天冬氨酸-β-半醛脫氫酶結(jié)合中心關(guān)鍵殘基突變，能夠增強輔助因子NAD（H）的利用[56]。EcASADH-Q350N 和 EcASADH-Q350N/H171A突變體在NADH存在時可有效合成L-高絲氨酸；相比野生型，EcASADH 在NADH 作為輔助因子的情況下生產(chǎn)的L-高絲氨酸較少。各策略應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌改造生產(chǎn)L-異亮氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量見表2。

表2 L-異亮氨酸各改造策略發(fā)酵產(chǎn)量Table 2 Fermentation yield of L-isoleucine by different transformation strategies

3 基因組整合

一般對于基因表達量的提高和外源基因的表達均是構(gòu)建于質(zhì)粒載體上的[57]，目前也開發(fā)了一系列能應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌的遺傳操作工具，如pXMJ19、pECXK99E 和pDXW-8[58]等。質(zhì)粒表達系統(tǒng)對于菌株的實驗室改造具有操作成熟、能實現(xiàn)較高表達量等優(yōu)勢，但應(yīng)用于工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)的菌株則表現(xiàn)出顯著的缺點。工業(yè)化生產(chǎn)過程中，由于質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，傳代過程中可能造成含質(zhì)粒菌株表達基因拷貝數(shù)的波動和質(zhì)粒丟失等問題，為了維持質(zhì)粒穩(wěn)定性和誘導表達需要添加大量抗生素和誘導劑，這不但降低了工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸等化學產(chǎn)品的經(jīng)濟效益[57]，而且抗生素的大規(guī)模應(yīng)用會嚴重污染環(huán)境[59]。

3.1 自殺質(zhì)粒介導同源重組

傳統(tǒng)基因組整合方式主要以同源重組的方式經(jīng)過2 次同源重組和2 次篩選驗證得到整合目的基因菌株，但是由于載體的轉(zhuǎn)化效率低、第一次同源重組效率低、依賴于抗生素標記基因的使用[60]和蔗糖篩選效率低等問題，需開發(fā)新的基因組整合工具。

一般谷氨酸棒桿菌的無痕敲除和基因組整合以pK18mobsacB、pK19mobsacB[61]和pK-JL[62]等成熟應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌敲除的自殺質(zhì)粒介導。pK18mobsacB 和pK19mobsacB 質(zhì)粒上帶有卡那霉素抗性基因kan和編碼果聚糖蔗糖酶的sacB基因，蔗糖存在時sacB基因?qū)劝彼岚魲U菌具有致死作用，因此sacB基因作為反向篩選標記，經(jīng)過2次同源重組和2 次篩選后得到目的菌株，但主要用于基因的敲除與交換[63]。隨后有研究證明pK18mobsacB 能夠在谷氨酸棒桿菌基因組水平上實現(xiàn)基因的過表達[57]。pK-JL 質(zhì)粒是pK18mobsacB 改良后的自殺質(zhì)粒，通過替換sacB基因前的啟動子為強啟動子tacM 后得到的[62]，因此提高了該質(zhì)粒應(yīng)用于基因組敲除和整合的蔗糖篩選效率，但上述載體仍存在轉(zhuǎn)化效率低、整合質(zhì)粒構(gòu)建周期長和第一次同源重組效率低等問題。

通過克隆表達載體pDXW-8 上的Ptac-iMCSrrnBT1T2 元件組裝到自殺質(zhì)粒pK18mobsacB 上，構(gòu)建了pK18-MBPMT[64]，該方法避免了表達質(zhì)粒的構(gòu)建，不含有遺傳標記，可明顯縮短構(gòu)建整合質(zhì)粒的時間，尤其對于重復整合等基因組水平過表達操作。同時，對谷氨酸棒桿菌基因組進行無標記特異性位點整合和片段缺失后，可提高L-賴氨酸產(chǎn)量。但該整合質(zhì)粒仍未解決轉(zhuǎn)化效率低及第一次同源重組效率低的問題。

通過進一步改良谷氨酸棒桿菌中自殺質(zhì)粒介導的基因編輯系統(tǒng)，將谷氨酸棒桿菌基因組上野生型rspL（編碼核糖體小亞基S12 蛋白）突變后獲得鏈霉素抗性，用強啟動子Ptuf 表達的野生型rpsL替換pK18mobsacB 中的sacB，因此完成第一次同源重組的菌株能夠在鏈霉素抗性平板生長；隨后液體培養(yǎng)，完成第二次同源重組的菌株能夠在卡那霉素抗性平板生長，相比pK18mobsacB 蔗糖篩選的30%陽性率，pK18mobrpsL 鏈霉素篩選陽性率提高至90%，并且由于鏈霉素和卡那霉素篩選效率較高，可以減少一步法實驗步驟和篩選周期，實現(xiàn)雙交換[13]。

3.2 Cre/loxP系統(tǒng)

Cre 重組酶（cyclization recombination enzyme）是在大腸桿菌噬菌體P1 中發(fā)現(xiàn)的，由Cre基因編碼，并由343 個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，其能夠特異性識別loxP（locus of X-overP1）位點[65]，loxP位點長34 bp，包括2個13 bp的反向重復序列和1個8 bp 的間隔區(qū)域[66]。反向重復序列是Cre 重組酶特異識別位點，間隔區(qū)域決定了loxP位點的方向。Cre/loxP 系統(tǒng)[67]同樣利用RecA基因介導的同源重組，經(jīng)過2 次同源重組后將靶基因替換為兩端帶有特異重組位點loxP 的kanR 片段，隨后通過溫敏型質(zhì)粒表達Cre 重組酶識別特異性重組位點loxP進行重組。2005 年，Suzuki 等[68]開發(fā)了基于Cre/loxP 系統(tǒng)對基因組更加精準的敲除方法，刪除了谷氨酸棒桿菌基因組上的11 個片段，共有250 kb成功敲除，隨后該團隊又報道了1 種新的基于Cre/突變loxP 基因組整合系統(tǒng)，其能夠?qū)愒椿蛘系焦劝彼岚魲U菌基因組，但是宿主菌必須含有突變基因，而待整合的外源基因必須包含選擇標記，如抗性標記等[14]。之后通過將自殺質(zhì)粒介導的同源重組與Cre/loxP 系統(tǒng)結(jié)合用于谷氨酸棒桿菌基因組敲除，提高了敲除篩選效率[69]。Cre/loxP 系統(tǒng)不僅在原核生物應(yīng)用廣泛，在真核生物生物中也表現(xiàn)出穩(wěn)定的基因組修飾。利用Cre/loxP 系統(tǒng)介導的同源重組技術(shù)失活釀酒酵母中編碼亞硫酸鹽還原酶的基因MET0提高了生產(chǎn)啤酒的抗氧化能力并改善了風味[70]；對耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中編碼與γ-癸內(nèi)酯合成相關(guān)的乙酰輔酶A 氧化酶POX5基因用Cre/loxP 同源重組系統(tǒng)進行敲除，成功獲得了pox5缺陷菌株。此外，Cre/loxP 系統(tǒng)對哺乳動物細胞，如小鼠[71]，由于其具有組織特異性、位點特異性和高效重組等優(yōu)勢，在轉(zhuǎn)基因動物構(gòu)建中得到了有效利用，同時也是體內(nèi)外DNA 重組的優(yōu)勢基因操作手段[72]。但經(jīng)過傳統(tǒng)誘變得到的谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)菌株時，RecA基因可能會引入非同義突變，甚至可能造成RecA基因表達蛋白的失活，不能介導同源重組。因此開發(fā)不依賴于RecA基因介導的重組系統(tǒng)具有重要意義，隨著RecT介導的單鏈重組和人工核酸酶介導的CRISPR的發(fā)展，Cre/loxP系統(tǒng)有望更快速、簡便、高效地應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌基因組編輯中。

3.3 RecET重組系統(tǒng)

原核生物同源重組大多依賴于內(nèi)源性的RecA 蛋白，自殺質(zhì)粒介導的同源重組一般是基于這種構(gòu)建環(huán)狀質(zhì)粒打耙載體實現(xiàn)基因無痕敲除、替換、插入與整合，但構(gòu)建所需同源臂較長，且篩選過程繁瑣。近年來，通過激活原噬菌體Rac 建立的RecET重組系統(tǒng)，成功應(yīng)用于基因組編輯中，并且不受限制性內(nèi)切酶切割位點和靶DNA 大小的限制，因此建立了依賴于RecET 介導的基因編輯系統(tǒng)[73]。RecET 系統(tǒng)不僅可以介導雙鏈DNA 重組，其中RecT 也可以介導單鏈DNA 重組，基于RecT/β 蛋白介導單鏈重組被用來大規(guī)模進化細胞[74]，實現(xiàn)了多樣自動化的基因組改造技術(shù)。

RecET 系統(tǒng)首先在大腸桿菌中應(yīng)用，通過PCR 擴增得到的DNA 同源片段替換大腸桿菌中的靶基因?qū)崿F(xiàn)了目的基因的敲除[75]。RecET 通常被構(gòu)建于質(zhì)粒上，由于大腸桿菌內(nèi)源存在recBCD，能夠降解外源線性雙鏈DNA，因此，RecET 系統(tǒng)的優(yōu)化主要集中于抑制recBCD基因功能，保證線性DNA 分子的完整性，從而順利利用RecET 系統(tǒng)介導雙鏈DNA 重組[76]。隨著RecET系統(tǒng)重組技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)70 bp 長的雙鏈DNA 和單鏈DNA 均可以作為打靶分子對基因組進行點突變和插入修飾[77]。單鏈重組的原理是將單鏈DNA 轉(zhuǎn)入細胞后，在基因組復制過程中，由于基因的半不連續(xù)復制，設(shè)計的單鏈DNA 以岡崎片段的形式結(jié)合于后隨鏈后在基因組穩(wěn)定遺傳。隨著單鏈重組技術(shù)在谷氨酸棒桿菌中的應(yīng)用，對多種RecT 同源蛋白進行比較優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)RecT 介導單鏈DNA 進行單鏈重組效果最好[78]。RecT 介導的單鏈重組也被用以構(gòu)建基因組多樣性文庫，并通過構(gòu)建單鏈DNA 文庫實現(xiàn)基因組多樣性[74]，但得到的突變體也需要與高通量的篩選技術(shù)相結(jié)合。

隨著基因組編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展，各種基因編輯技術(shù)結(jié)合實現(xiàn)基因組的高效編輯和高效篩選成為一種基因組改造策略。如將RecET 技術(shù)和Cre/loxP 系統(tǒng)結(jié)合，實現(xiàn)了對谷氨酸棒桿菌ATCC 14067無標記缺失[79]，這也為谷氨酸棒桿菌基因編輯提供了一種無標記操作策略。通過優(yōu)化CRISPR/Cpf1和RecET系統(tǒng)，實現(xiàn)了對谷氨酸棒桿菌基因組大片段多基因的編輯[80]，利用crRNA、CRISPR/Cpf1-RecET 一步可以編輯2～3 個基因，效率分別為91.6%和10%，1、5、20 kb 的編輯效率分別為79.6%、91.3%、36.4%。

3.4 CRISPR/Cas9

規(guī)律間隔成簇短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是指含有較多短的不連續(xù)的重復序列（24～37 nt），Cas 是指與CRISPR 相關(guān)的蛋白，二者共同作用組成CRISPR-Cas 系統(tǒng)，用以抵御外來因子RNA 介導的獲得性免疫系統(tǒng)。CRISPR 前導序列（leader sequence）類似于啟動子，富含A/T 低復雜性的非編碼區(qū)，起始轉(zhuǎn)錄重復間隔序列并生成crRNA（CRISPR RNAs）前體，CRISPR 序列往往鄰近cas基因，隨后間隔區(qū)（spacers）識別外來遺傳因子，crRNA 與Cas 蛋白共同參與免疫防御過程。來自化膿球桿菌的Cas效應(yīng)蛋白SpCas9對谷氨酸棒桿菌存在毒性，通過使用來自鏈霉菌的SpCas9發(fā)現(xiàn)其能夠在谷氨酸棒桿菌中得到轉(zhuǎn)化子，同時結(jié)合單鏈重組系統(tǒng)刪除了谷氨酸棒桿菌基因組400 bp左右，但更大片段的刪除、插入以及點突變等尚未測試。由于谷氨酸棒桿菌在工業(yè)化生產(chǎn)氨基酸等發(fā)酵產(chǎn)品有良好性能，被越來越多的進行改造并用于發(fā)酵生產(chǎn)[81]，但目前主要對谷氨酸棒桿菌的基因組改造主要依賴于效率極低的同源雙交換[82]。CRISPR/Cas9 具有效率高、價格低廉、操作簡單等優(yōu)勢，并廣泛應(yīng)用于哺乳動物、植物和微生物中，谷氨酸棒桿菌也開發(fā)了基于CRISPR/Cas9 的基因組編輯系統(tǒng)[83]，未來有望應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

同時，有研究指出SpCas9 具有毒性，因此使用來自Francisella novicida（FN）的Cas9 效應(yīng)蛋白（FNCpf1）與谷氨酸棒桿菌適配，同時結(jié)合單鏈重組系統(tǒng)，能夠?qū)蚪M進行刪除、插入等精細修改，明顯縮短了基因組編輯周期[84]。有研究在恥垢分枝桿菌中測試了14種不同Cas9效應(yīng)蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個Cas9基因不影響恥垢分枝桿菌的生長，而且表現(xiàn)出了更高的切割活性[85]。因此，F(xiàn)NCpf1 相比于SpCas9 更適合用于對谷氨酸棒桿菌基因組編輯，并且有更廣泛的適用空間。

CRISPR/Cas9 除了直接用于基因組編輯，目前還作為1 種如RecT 介導的單鏈重組技術(shù)和非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）的高效篩選策略。RecT 介導的單鏈重組技術(shù)通過幾十個堿基作為單鏈DNA 即可實現(xiàn)基因組編輯，但重組子陽性率較低。通過在谷氨酸棒桿菌中利用CRISPR-Cas9介導突變后重組子作為輔助篩選策略[86]，顯著提高了篩選效率，減輕工作周期，使RecT介導的單鏈重組技術(shù)能更高效地應(yīng)用于基因組編輯。隨著基因組編輯技術(shù)深入地發(fā)展以及在谷氨酸棒桿菌中的廣泛應(yīng)用，同時，各個編輯技術(shù)之間的協(xié)同輔助策略也能夠為谷氨酸棒桿菌中的基因組編輯操作提供更高效的工具。

4 展望

L-異亮氨酸作為人體8 種必需氨基酸之一，在食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，且需求量逐年上升。但工業(yè)發(fā)酵L-異亮氨酸大部分通過隨機誘變得到，菌株穩(wěn)定性差，目前主流方法為隨機誘變后的菌株再進行理性改造。理性改造策略除了針對L-異亮氨酸生物合成途徑關(guān)鍵酶的過表達、轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、關(guān)鍵酶的催化活性反饋抑制能力外，代謝工程改造氨基酸高產(chǎn)菌株的關(guān)鍵還在于改善胞內(nèi)NADPH 的供應(yīng)。傳統(tǒng)代謝工程對于氨基酸代謝途徑關(guān)鍵基因操作的分析改造非常重要，而且酶挖掘和輔助因子工程相結(jié)合也是提高氨基酸產(chǎn)量的高效方法。由于質(zhì)粒的穩(wěn)定性差，開發(fā)更高效的基因組遺傳操作工具尤為重要，隨著基因組操作工具水平的提高，以谷氨酸棒桿菌為底盤細胞的發(fā)酵生產(chǎn)水平也必將大幅提高。

隨著全基因組測序、轉(zhuǎn)錄組學、代謝組學等現(xiàn)代生物學技術(shù)的發(fā)展，以及生物信息學與計算機建模技術(shù)與生命科學多學科融合，未來對谷氨酸棒桿菌代謝的改造需從菌株整體代謝網(wǎng)絡(luò)出發(fā)，通過全局分析以及代謝流重構(gòu)，從而進一步提高谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)L-異亮氨酸的產(chǎn)量。