李坤，金麗華

東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150000

果蠅造血過程貫穿整個生命周期，在免疫響應(yīng)和營養(yǎng)物質(zhì)運輸中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其主要分為胚胎階段和幼蟲階段［1］。胚胎階段血細(xì)胞從頭部中胚層運出，隨后移動到全部胚胎；在幼蟲階段，淋巴腺是主要的造血器官。2 個階段的血細(xì)胞均可保留至成蟲時期，維持果蠅成蟲的生命活動。除上述2 個階段外，近年來，研究發(fā)現(xiàn)，果蠅成蟲時期可能也存在造血器官。2015年，Ghosh等［2］發(fā)現(xiàn)果蠅成蟲背部存在4 個由不同血細(xì)胞組成的細(xì)胞群，其具有一定的造血功能；然而，2019年，Sanchez 等［3］的研究表明，這些細(xì)胞群中血細(xì)胞不具有增殖能力，因此，成蟲階段的造血作用仍存在爭議。

淋巴腺發(fā)育過程從胚胎時期開始并于三齡幼蟲時期成熟，蛹期淋巴腺裂解，釋放血細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并保留至成蟲期［4］。成熟淋巴腺中的前體血細(xì)胞類似于哺乳動物骨髓造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSC），后端信號中心區(qū)細(xì)胞近似于干細(xì)胞微環(huán)境，成熟血細(xì)胞與哺乳動物髓系血細(xì)胞功能相似；并且，淋巴腺的穩(wěn)態(tài)由一系列與哺乳動物高度保守的因子和信號通路調(diào)控，因此，淋巴腺已成為研究造血功能的重要模型［5］。本文總結(jié)了血細(xì)胞類型和功能、淋巴腺發(fā)育過程及調(diào)控淋巴腺穩(wěn)態(tài)的幾種典型信號通路，以期為淋巴腺血細(xì)胞的功能研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 果蠅的3種血細(xì)胞類型及其功能

目前在果蠅中已鑒定出3 種形態(tài)功能不同的血細(xì)胞，包括漿細(xì)胞（plasmatocytes）、晶細(xì)胞（cystal cells）和薄層細(xì)胞（lamellocytes），分別具有產(chǎn)生抗菌肽、吞噬和促進(jìn)傷口愈合等功能［6］。健康果蠅的淋巴腺可以產(chǎn)生2 種成熟血細(xì)胞，即漿細(xì)胞和晶細(xì)胞（圖1），它們可以持續(xù)生存到蛹期和成蟲期；此外，還存在另一種成熟血細(xì)胞，即薄層細(xì)胞，其只有在黃蜂寄生或病原體感染時才能被誘導(dǎo)產(chǎn)生［5］。

1.1 漿細(xì)胞

漿細(xì)胞類似于哺乳動物的巨噬細(xì)胞，直徑為8～10 μm，相對較小，占血細(xì)胞總數(shù)的90%～95%，其細(xì)胞質(zhì)較多，并含有豐富的溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等［7］。漿細(xì)胞的主要功能為專一性噬菌、吞噬和降解死亡細(xì)胞及碎片和入侵的病原體。CD36 家族成員受體中的Crq 具有調(diào)節(jié)漿細(xì)胞識別凋亡細(xì)胞的功能［8］。除參與細(xì)胞免疫外，漿細(xì)胞分泌的抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）蛋白，分別介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)或促進(jìn)組織形成［9］。標(biāo)記漿細(xì)胞的蛋白主要有血凝素（hemolectin，Hml）、過氧化物酶（peroxidasine，Pxn）、P1 抗原（NimC1）蛋白、Croquemort（Crq）蛋白、膠原蛋白（Collagen）和Eater蛋白等，可以根據(jù)漿細(xì)胞的分化程度選取不同的標(biāo)記物進(jìn)行鑒定［10］。

1.2 晶細(xì)胞

晶細(xì)胞直徑為10～12 μm，略大于漿細(xì)胞，占血細(xì)胞總數(shù)的2%～5%，因含有介導(dǎo)黑色素形成的酚氧化酶原（prophenoloxidase，PPO）而具有黑化作用［11］。作為一種非吞噬性的血細(xì)胞，晶細(xì)胞通過釋放與黑色素化相關(guān)的蛋白酶，以促進(jìn)天然免疫和傷口愈合［12］。黑色素化是一種蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)，晶體內(nèi)含物中的PPO 能夠活化游離血細(xì)胞中的酚氧化酶（phenol oxidase，PO），并催化酚類氧化成醌類，進(jìn)而聚合成黑色素。黑色素與其產(chǎn)物，如過氧化氫、氮的氧化物等會直接導(dǎo)致微生物中毒［13］。

果蠅的3個獨立基因PPO1、PPO2和PPO3編碼PPO 酶，PPO3在薄層細(xì)胞中表達(dá)，PPO1 和PPO2在晶細(xì)胞中表達(dá)［13］。Notch 信號通路在晶細(xì)胞分化中起主要作用，Notch 及其下游效應(yīng)物L(fēng)ozenge（Lz）能夠激活靶基因klumpfuss和pebbled/hindsight共同促進(jìn)晶細(xì)胞分化［14］。晶細(xì)胞分化早期的標(biāo)記物為Lz 或pebbled/Hindsight（Hnt），晚期標(biāo)記物為酚氧化酶原（prophenoloxidase，ProPO）［15］。

1.3 薄層細(xì)胞

薄層細(xì)胞大而扁平，形狀不規(guī)則，直徑為15～40 μm，不具有吞噬能力，但通常含有比漿細(xì)胞更多的溶酶體和吞噬小泡［16］。一般情況下，薄層細(xì)胞不易在幼蟲階段觀察到，但在免疫刺激（如黃蜂寄生、傷害或機(jī)械應(yīng)力）下大量產(chǎn)生，其可包裹和殺死過大而無法被吞噬的異物。與漿細(xì)胞和晶細(xì)胞不同，薄層細(xì)胞僅可能在幼蟲體內(nèi)產(chǎn)生，對于胚胎或成蟲期，即便是在黃蜂感染后也不會出現(xiàn)［17］。研究表明，許多信號通路參與了薄層細(xì)胞的分化，如Notch、JAK/STAT、JNK、Toll、EGFR 和ecdysone［18］。JNK 通路在決定薄層細(xì)胞命運中起關(guān)鍵作用，該途徑的主要成分Basket（Bsk）、Msn、Puckered（Puc）、Hemipterous（Hep）、Kayak（Kay）和FOXO 均參與了這一過程［19］。標(biāo)記薄層細(xì)胞的蛋白包括Atilla、β-PS 整合素（由myospheroid 編碼）、α-PS4 整合素、Misshapen（Msn）、Puckered、PPO3、L2或L6［20］。

2 淋巴腺

2.1 淋巴腺的形成

在胚胎發(fā)育的第13 階段，淋巴腺的前體在心源性中胚層表現(xiàn)為局部隆起［21］。這些淋巴腺前體向背側(cè)遷移，形成與背側(cè)血管相關(guān)的緊密細(xì)胞簇，最終形成包括位于背側(cè)血管側(cè)面的多個葉的成對鏈。在第13～16階段，果蠅胚胎的T1～T3 3個體節(jié)中鋅指蛋白Odd陽性的細(xì)胞簇合并形成早期淋巴腺，而腹部中的Odd 陽性細(xì)胞簇則形成心包細(xì)胞［22］。此時胚胎觸足復(fù)合群基因（Antennapedia，Antp）的表達(dá)僅局限于T3體節(jié)的5～6個細(xì)胞內(nèi)，這些細(xì)胞隨著細(xì)胞簇被合并至早期淋巴腺的后端被稱為后部信號中心（rear signal center，PSC）。一級淋巴腺的其余細(xì)胞由T1～T2區(qū)段產(chǎn)生的Odd陽性細(xì)胞簇發(fā)育而來［23］。

一齡和二齡早期幼蟲的一級淋巴腺主要由表達(dá)Dome 的細(xì)胞組成。在這個階段，淋巴腺中Dome 陽性的前體細(xì)胞開始堆積，細(xì)胞間接觸緊密［24］。到二齡晚期，一級淋巴腺中出現(xiàn)表達(dá)Hml和Pxn 的細(xì)胞，表明血細(xì)胞開始分化，將形成二級和三級淋巴腺［25］。淋巴腺在三齡幼蟲時逐漸成熟，一級淋巴腺被分為3個不同的區(qū)域，即髓質(zhì)區(qū)（medullary zone，MZ）、皮質(zhì)區(qū)（cortical zone，CZ）及后端信號中心區(qū)（posterior signal center，PSC）［26］，分別行使不同的功能。在蛹期，MZ細(xì)胞增殖并分化為終末成熟血細(xì)胞，PSC 細(xì)胞在整個淋巴腺中擴(kuò)散。在蛹形成后15 h 內(nèi)，淋巴腺逐漸裂解至完全消失，并將血細(xì)胞全部釋放于體腔中［27］。

2.2 淋巴腺的不同區(qū)域

三齡幼蟲完全發(fā)育時，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和血細(xì)胞類型等，一級淋巴腺可分成MZ 區(qū)、CZ 區(qū)和PSC區(qū)3個區(qū)（圖1）。MZ區(qū)位于一級淋巴腺內(nèi)部中央?yún)^(qū)域，含有緊密相連的干細(xì)胞樣前體細(xì)胞，可以產(chǎn)生組成CZ 區(qū)的3 種成熟血細(xì)胞，即漿細(xì)胞、晶細(xì)胞和薄層細(xì)胞（健康的幼蟲體內(nèi)極少）［28］，且MZ區(qū)可由Dome、Tep4 和DE-cad 來定位［29］。CZ 區(qū)中成熟血細(xì)胞排列松散，可表達(dá)Hml、Lz、Pxn、P1 和Eater［30］。在MZ 和CZ 之間，有一個區(qū)域為中間前體血細(xì)胞（intermediate precursor blood cells，IPs），在這里細(xì)胞經(jīng)歷從前體細(xì)胞到特定成熟血細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，它們具有比成熟的漿細(xì)胞和晶細(xì)胞更高的有絲分裂活性［31］。淋巴腺另一個關(guān)鍵區(qū)域為PSC細(xì)胞，約由30個細(xì)胞組成，位于后部并與MZ前體血細(xì)胞相鄰，在維持淋巴腺穩(wěn)態(tài)方面起重要的調(diào)節(jié)作用［32］。PSC 細(xì)胞可被Serrate（Ser）、Col、Antp和Hedgehog（Hh）特異性標(biāo)記［30］。淋巴腺的后葉由二級、三級和四級淋巴腺組成，類似于一級淋巴腺的MZ 區(qū)，由高表達(dá)DE-cad、Dome 和Col 的緊密堆積的前體血細(xì)胞組成［33］。

圖1 三齡幼蟲一級淋巴腺Fig.1 The primary lobe of lymph gland at third instar larval stage

3 淋巴腺發(fā)育過程中的信號調(diào)控

3.1 Notch信號

Notch信號是在發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和組織分化過程中參與細(xì)胞命運調(diào)節(jié)的保守信號通路［34］。在果蠅幼蟲造血過程中Notch 信號參與晶細(xì)胞的分化和淋巴腺的維持。Notch 的胞外結(jié)構(gòu)域與位于相鄰細(xì)胞膜上的配體蛋白Delta和Ser相互作用，Notch 蛋白裂解并釋放Notch 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（notch intracellular domain，NICD）進(jìn)入細(xì)胞核，通過轉(zhuǎn)錄因子Suppressor of Hairless［Su（H）］激活下游靶基因的表達(dá)［35］。

果蠅有2 個Notch 配體，即Delta 和Ser。Delta維持MZ 區(qū)穩(wěn)態(tài)［36］，而Ser 在PSC 細(xì)胞中高度表達(dá)，通過調(diào)節(jié)Col的轉(zhuǎn)錄來維持PSC區(qū)細(xì)胞數(shù)量和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［37］。Notch 在三齡幼蟲一級淋巴腺中普遍表達(dá)［38］。在MZ 的前體血細(xì)胞中，Notch 通路促進(jìn)未分化的血細(xì)胞向晶細(xì)胞分化，過表達(dá)Notch、Ser 或Su（H）可顯著增加晶細(xì)胞數(shù)量并阻止?jié){細(xì)胞分化［39］。Runx 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子Lz 是決定晶細(xì)胞命運的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［40］。Srp 與Lz 相互作用，控制Lz轉(zhuǎn)錄并決定晶細(xì)胞命運。Lz與Notch信號協(xié)同作用，有選擇地激活與晶細(xì)胞分化相關(guān)的靶基因，進(jìn)一步確定晶細(xì)胞的命運，并阻止其向其他細(xì)胞分化［41］；并且，Srp 和Lz 協(xié)同作用可上調(diào)Ush的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)晶細(xì)胞數(shù)量。Srp 和Lz 共同調(diào)控成熟晶細(xì)胞中的ProPO 表達(dá)［42-43］。除調(diào)控晶細(xì)胞命運外，Notch信號也調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。研究表明，Notch 或Su（H）突變體果蠅的淋巴腺明顯小于野生型［44］。

3.2 JAK/STAT信號

果蠅的JAK/STAT 信號通路包括3 種細(xì)胞因子，即Upd1、Upd2 和Upd3，細(xì)胞因子受體［Domeless（Dome）］及下游的JAK（Hop）和STAT（Stat92E）。當(dāng)細(xì)胞外配體與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，Jak 激酶被激活。隨后，高度保守的C 末端酪氨酸殘基被磷酸化，激活胞質(zhì)二聚體。磷酸化的二聚體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與基因組調(diào)控區(qū)域的特定位點結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)［45］。受體Dome 作為前體血細(xì)胞的一個常見標(biāo)記物在MZ 中高度表達(dá)，并維持前體血細(xì)胞處于未分化狀態(tài)［46］。

位于JAK/STAT途徑下游的Ush促進(jìn)MZ的Ecad 和Ptc 表達(dá)，進(jìn)而阻止細(xì)胞過度分化［47］。在血細(xì)胞分化前，Ush 在所有未成熟細(xì)胞中表達(dá)，在細(xì)胞分化為成熟血細(xì)胞后其表達(dá)量降低。Ush 的單拷貝突變體中MZ 的E-cad 和Ptc 水平降低，導(dǎo)致淋巴腺漿細(xì)胞和晶細(xì)胞數(shù)量增加［48］。另一個抑制MZ 分化的下游因子為內(nèi)體運輸?shù)鞍譇rj［49］。Arj在胚胎、幼蟲和成蟲階段的所有血細(xì)胞中表達(dá)［50］，在整個淋巴腺也有表達(dá)，并與STAT 結(jié)合，促進(jìn)其磷酸化而被激活［51］。

STAT還介導(dǎo)一個獨立于Dome-JAK通路的平衡信號來維持前體血細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［52］。雖然Stat92E在整個一級淋巴腺中均有表達(dá)，但只在CZ區(qū)發(fā)揮維持前體血細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的功能［53］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CZ 區(qū)中的STAT 在PDGF/VEGF 受體（PDGF/VEGF receptor，PVR）信號的下游發(fā)揮作用，PVR被PSC區(qū)細(xì)胞的配體PVF1激活，進(jìn)而促進(jìn)腺苷脫氨酶相關(guān)生長因子（adenosine deaminase related growth factor，ADGF）的表達(dá)［54］。PVF-PVR-STAT信號級聯(lián)在早期能夠促進(jìn)淋巴腺增殖，后期在非自主地維持MZ 中前體血細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用［55］。

3.3 Hh信號

Hh信號十分保守，在發(fā)育和器官形成過程中可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和分化。當(dāng)Hh配體與跨膜受體Patched（Ptc）結(jié)合時，該通路被激活。解除了Ptc 對G 蛋白樣受體Smo 向細(xì)胞膜移動的抑制作用，進(jìn)而抑制Ci蛋白水解。全長Ci得以保留并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，調(diào)節(jié)基因表達(dá)［56］。

淋巴腺的Hh 信號對于維持MZ 前體血細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要意義。Hh 在二齡和三齡幼蟲淋巴腺的PSC 細(xì)胞中表達(dá)，其受體Ptc 和下游Smo、Ci在MZ 中高度表達(dá)。在hhTS突變體或在PSC 區(qū)中誘導(dǎo)hh RNAi 后，PSC 區(qū)的大小和形態(tài)不受影響，但成熟血細(xì)胞數(shù)量明顯增加［57］。Ci和Smo功能受損或Ptc 異位表達(dá)的淋巴腺會出現(xiàn)MZ 中的前體血細(xì)胞數(shù)量減少的現(xiàn)象［58］。相反，Ptc過量表達(dá)或通過抑制負(fù)調(diào)控Ci轉(zhuǎn)錄活性的suppressor of fused（Sufu）激活MZ 中的Hh 信號后，前體血細(xì)胞大量增加，成熟血細(xì)胞明顯減少。以上結(jié)果表明，Hh信號源于PSC細(xì)胞，在MZ中起著維持前體血細(xì)胞造血前體狀態(tài)，并阻止其分化的作用［59-60］。

3.4 其他信號

Wg/Wnt信號在決定細(xì)胞命運、細(xì)胞增殖和穩(wěn)態(tài)中起重要的調(diào)節(jié)作用。Wg 蛋白在整個淋巴腺中均有表達(dá)，能夠維持MZ 完整性并抑制前體血細(xì)胞分化，在PSC 區(qū)中通過原癌基因dMyc調(diào)節(jié)PSC 細(xì)胞數(shù)量［61］。鈣信號在PSC 和MZ 中均有表達(dá)，MZ 的鈣信號傳導(dǎo)是維持前體血細(xì)胞所必需的，在PSC區(qū)中能促進(jìn)早期淋巴腺發(fā)育［62］。另外，F(xiàn)GF 信號通過Ht1、Ras/MAPK、轉(zhuǎn)錄因子Pnt 和Ush 促進(jìn)淋巴腺的血細(xì)胞分化［63］。BMP/Dpp 信號在PSC 區(qū)中被特異性激活，通過抑制dMyc的表達(dá)來維持PSC細(xì)胞數(shù)量［64］。

來自背部血管的信號中，背部血管產(chǎn)生的Slit配體可激活PSC 中的Robo 信號，從而控制PSC 區(qū)的細(xì)胞數(shù)量和聚集。最新的研究表明，心肌細(xì)胞產(chǎn)生的FGF 通路配體bnl 可能不通過PSC 而直接作用于MZ 的前體血細(xì)胞，進(jìn)而維持淋巴腺穩(wěn)態(tài)［64］。除以上信號外，營養(yǎng)信號InR/TOR、Hippo通路、Toll 通路以及Jumu、Bag-of-marbles（Bam）、腺苷酸核糖基化因子1（ADP ribosylation factor 1，ARF1）等也在維持淋巴腺穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［55］。

4 展望

果蠅是一種典型的模式生物，對遺傳學(xué)研究具有重要作用。白血病是嚴(yán)重危脅人們生命安全的重大疾病，居我國腫瘤死亡率的第6位［65］，其中急性髓系白血病是一類起源于髓系造血祖細(xì)胞的惡性增殖性疾?。?6］。由于果蠅與哺乳動物造血系統(tǒng)在調(diào)節(jié)因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間存在相似性，因此，果蠅淋巴腺可作為研究哺乳動物造血疾病的理想模型。淋巴腺中含有未分化的前體血細(xì)胞和多種類型的成熟血細(xì)胞，有利于研究細(xì)胞譜系、造血干細(xì)胞的維持與分化等相關(guān)問題。近年來，研究發(fā)現(xiàn)在MZ 與CZ 之間還有一類特殊的IPs 細(xì)胞，狀態(tài)處于前體血細(xì)胞和成熟血細(xì)胞中間，因此，對于淋巴腺血細(xì)胞的詳細(xì)分類和相應(yīng)的功能有待進(jìn)一步研究。

許多經(jīng)典的發(fā)育信號通路已被證明在淋巴腺造血過程中起著至關(guān)重要的作用，淋巴腺中的PSC 區(qū)作為信號中心為其他區(qū)域提供信號分子，維持果蠅正常的造血功能。MZ 的前體血細(xì)胞受Wg、JAK/STAT 等信號調(diào)節(jié)。MZ 的自主性調(diào)節(jié)信號及來自PSC 區(qū)（如Hh 信號）和CZ（如平衡信號）的非自主性調(diào)節(jié)信號，共同調(diào)節(jié)血細(xì)胞分化。Notch、Wg 和Lz 信號可協(xié)同調(diào)節(jié)血細(xì)胞向晶細(xì)胞方向分化。目前，關(guān)于調(diào)節(jié)幼蟲造血穩(wěn)態(tài)的研究已取得了巨大的進(jìn)展，但這些調(diào)節(jié)信號之間的交叉部分仍未完全明確，有待進(jìn)一步深入研究。