吳 江，張國(guó)梁，劉連升，郭 瓊，任寶瑞，宋振宇，劉繼光，施 維

(1.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002；2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130012)

目前，口腔癌已經(jīng)成為全球性健康難題之一[1,2]?？谇粣盒阅[瘤中主要以舌鱗癌最為常見。基因治療在惡性腫瘤研究方面尚處于嘗試性實(shí)踐研究階段。基因治療主要是以改變靶細(xì)胞遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ)，將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，最終達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)治療手段[3,4]。外源毒素基因?qū)儆谕庠椿蛑械淖詺⒒?，其具有持久、穩(wěn)定、有效殺死靶細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)[5～9]。銅綠假單胞菌外毒素(pseudomonas aeruginosa exotoxin，PE)是可利用的外源毒素之一，屬于自殺基因。實(shí)驗(yàn)中選用的毒素基因PE38KDEL是一種廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的非特異性分子細(xì)菌毒素PE的衍生物，具有相對(duì)分子量較小、殺傷力強(qiáng)、免疫原性小的特點(diǎn)[10～12]。

實(shí)驗(yàn)前期已經(jīng)根據(jù)SERPINB3基因在人舌鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的特異性，利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建以SERPINB3啟動(dòng)子調(diào)控的PE38KDEL毒素質(zhì)粒，并且已經(jīng)通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SERPINB3啟動(dòng)子在舌鱗癌細(xì)胞中具有強(qiáng)表達(dá)活性；pSERPINB3-PE38KDEL毒素質(zhì)?？梢园邢蛞种芓CA8113細(xì)胞蛋白合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建人舌鱗狀細(xì)胞癌裸鼠皮下移植瘤模型，經(jīng)過質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染進(jìn)一步驗(yàn)證pSERPINB3-PE38KDEL毒素質(zhì)粒具有靶向抑制舌鱗癌的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(TCA8113)為吉林大學(xué)生命科學(xué)院施維教授提供。SPF級(jí)，5周齡，裸鼠BALB/c-nu許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。奧林巴斯顯微鏡(Olympus OPTICAL CO.,LTD)，流式細(xì)胞儀(BD)，Annexin V-FITC PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海貝博生物)，TUNEL試劑盒(北京中杉)，免疫組化試劑盒(福州邁新)，Ki-67抗體(NO. ab16667，ABCAM)，DAB顯色劑(福州邁新)，復(fù)合消化液(武漢博士德)。

1.2 人舌鱗狀細(xì)胞癌皮下異位瘤移植BALB/c-nu小鼠模型的構(gòu)建

將 5周齡BALB/c-nu裸鼠15只隨機(jī)分成3組，每組5只小鼠，組別是空白對(duì)照組(注射生理鹽水)、pGL3-Basic陰性質(zhì)粒組、pSERPINB3-PE38KDEL毒素質(zhì)粒。用帶有6號(hào)針頭的1mL注射器，將事先用PBS溶液配置好的人舌鱗狀細(xì)胞癌TCA8113細(xì)胞懸液接種于小鼠腹股溝中上部皮下，每只小鼠注射0.1mL(細(xì)胞個(gè)數(shù)為1×106)。每3天觀測(cè)記錄腫瘤大小1次，腫瘤體積用游標(biāo)卡尺測(cè)量，按體積計(jì)算公式 腫瘤體積v= ab2/2(a為腫瘤最長(zhǎng)徑，b為與a垂直的最長(zhǎng)短徑，體積單位為mm3)計(jì)算腫瘤體積并測(cè)量小鼠質(zhì)量，并且觀察小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.3 質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染

當(dāng)腫瘤平均體積達(dá)到50mm3時(shí)，進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒用量根據(jù)小鼠體重，按照0.625mg質(zhì)粒/kg計(jì)算，質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑PEI的用量=1:1.33的比例進(jìn)行計(jì)算，分別配制相應(yīng)的質(zhì)粒與PEI溶液，靜置5min，再將PEI溶液緩慢加入質(zhì)粒溶液中，37℃孵育30min，質(zhì)粒與PEI形成復(fù)合物后，用作體內(nèi)轉(zhuǎn)染備用。空白對(duì)照組按照質(zhì)粒的計(jì)算方式注射相應(yīng)的生理鹽水。每3天給藥1次，并觀測(cè)記錄腫瘤體積1次，電子天平稱量裸鼠體重1次。

1.4 動(dòng)物處死及標(biāo)本收集

待模型鼠空白對(duì)照組的腫瘤平均體積接近1500mm3時(shí)，及時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行處置。小鼠處理的具體步驟如下：用頸椎脫臼法處死所有小鼠，用眼科剪刀、鑷子等手術(shù)器械將腫瘤組織、相關(guān)重要臟器(心、肝、脾、肺、腎)剝出，生理鹽水清洗后，迅速置于事先準(zhǔn)備好的10 %的中性緩沖甲醛固定液中固定，經(jīng)過梯度乙醇脫水，將組織塊浸入石蠟中浸蠟、包埋，制成標(biāo)本蠟塊，切成石蠟切片，檢測(cè)備用。

1.5 HE 染色觀察

樣本取自空白對(duì)照組、pGL3-Basic陰性質(zhì)粒組、pSERPINB3-PE38KDEL毒素質(zhì)粒組的為心、肝、脾、肺、腎、腫瘤組織標(biāo)本蠟塊，切成石蠟切片后并進(jìn)行HE染色后，每張隨機(jī)選取5個(gè)視野，顯微鏡下觀察組織變化情況。

1.6 TUNEL檢測(cè)

樣本取自空白對(duì)照組、pGL3-Basic陰性質(zhì)粒組、pSERPINB3-PE38KDEL毒素質(zhì)粒三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠腫瘤組織標(biāo)本的石蠟切片，利用TUNEL檢測(cè)試劑盒步驟進(jìn)行，通過對(duì)比觀察。根據(jù)顯微鏡下細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，染色體、細(xì)胞核等的情況進(jìn)而觀察經(jīng)過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后腫瘤組織的細(xì)胞狀態(tài)，評(píng)估pSERPINB3-PE38KDEL毒素質(zhì)粒是否對(duì)能夠在小鼠體內(nèi)靶向誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞凋亡。

1.7 Ki-67免疫組化

樣本取自空白對(duì)照組、pGL3-Basic陰性質(zhì)粒組、pSERPINB3-PE38KDEL毒素質(zhì)粒的小鼠腫瘤組織標(biāo)本的石蠟切片。進(jìn)行Ki-67免疫組化檢測(cè)，每張隨機(jī)選取5個(gè)視野，顯微鏡下觀察。根據(jù)Ki-67抗原在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況，驗(yàn)證通過體內(nèi)轉(zhuǎn)染pSERPINB3-PE38KDEL毒素質(zhì)粒靶向誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞凋亡。

2 結(jié)果

2.1 pSERPINB3-PE38KDEL毒素質(zhì)粒在舌鱗狀細(xì)胞癌(TCA8113)皮下異位瘤移植BALB/c-nu小鼠模型體內(nèi)的抑瘤作用

圖1所示，實(shí)驗(yàn)周期共16d，空白對(duì)照組平均腫瘤體積最終達(dá)到1479.21mm3終止給藥。此時(shí)，pGL3-Basic組與空白對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)情況相似，16d內(nèi)平均腫瘤體積達(dá)到1183.56mm3，pSERPINB3-PE38KDEL毒素質(zhì)粒組16 d內(nèi)平均腫瘤體積達(dá)到582.22mm3。此外，荷瘤小鼠的體重及生長(zhǎng)狀態(tài)在治療過程中各組間無明顯波動(dòng)變化。

(b)

2.2 HE染色結(jié)果

圖2(a、b、c、d、e)結(jié)果所示，發(fā)現(xiàn)心、肝、脾、肺、腎5種臟器組織中未見明顯的病理變化，細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常。圖2(f)所示，腫瘤組織的HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組和pGL3-Basic陰性質(zhì)粒組未見明顯細(xì)胞凋亡信號(hào)，其中細(xì)胞核呈深藍(lán)色染色，腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整的比例較高，細(xì)胞增殖明顯；而pSERPINB3-PE38KDEL毒素質(zhì)粒組，染色較淺，凋亡細(xì)胞密度較高，染色體發(fā)生皺縮。

圖2 不同質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染后小鼠各部分組織的HE染色結(jié)果(50 μm，20×)

2.3 TUNEL結(jié)果

經(jīng)不同質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染處理后，舌鱗狀細(xì)胞癌(TCA8113)皮下異位瘤移植BALB/c-nu小鼠腫瘤組織的TUNEL染色(圖3)結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組和pGL3-Basic陰性質(zhì)粒組未見明顯細(xì)胞凋亡，細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色，細(xì)胞增殖明顯；pSERPINB3-PE38KDEL質(zhì)粒組中出現(xiàn)大量凋亡的棕色細(xì)胞。

圖3 不同質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染后小鼠腫瘤組織的TUNEL染色結(jié)果(50 μm，20×)

2.4 Ki-67免疫組化結(jié)果

經(jīng)不同質(zhì)粒(pGL3-Basic質(zhì)?；騪SERPINB3-PE38KDEL質(zhì)粒)體內(nèi)轉(zhuǎn)染處理后的舌鱗狀細(xì)胞癌(TCA8113)皮下異位瘤移植BALB/c-nu小鼠腫瘤組織的Ki-67免疫組化結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)pSERPINB3-PE38KDEL質(zhì)粒組的細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色，Ki-67的表達(dá)減少，細(xì)胞凋亡明顯；而pGL3-Basic質(zhì)粒組與空白對(duì)照組呈現(xiàn)大量的棕色細(xì)胞，Ki-67的表達(dá)增加，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的增殖。

圖4 不同質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染后小鼠腫瘤組織的Ki-67免疫組化結(jié)果(50 μm，20×)

3 討論

在成功構(gòu)建人舌鱗狀細(xì)胞癌裸鼠皮下移植瘤模型的基礎(chǔ)上，經(jīng)過質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染后，小鼠的體重及生長(zhǎng)狀態(tài)在治療過程中各組間無明顯波動(dòng)變化，再對(duì)小鼠的心、肝、脾、肺、腎以及腫瘤組織分別進(jìn)行研究。HE染色和TUNEL結(jié)果說明通過體內(nèi)轉(zhuǎn)染，pSERPINB3-PE38KDEL毒素質(zhì)粒在對(duì)正常組織部未造成明顯損害的情況下，可以靶向誘導(dǎo)舌鱗狀細(xì)胞癌荷瘤小鼠腫瘤組織的細(xì)胞凋亡。Ki-67是一種抗凋亡蛋白，Ki-67抗原的表達(dá)水平與細(xì)胞增殖成正比，Ki-67抗原的表達(dá)量增加，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯增殖，細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)棕色；然而，Ki-67抗原的表達(dá)量減少，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯凋亡，細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)藍(lán)色，因此Ki-67免疫組化結(jié)果說明pSERPINB3-PE38KDEL毒素質(zhì)粒可以在體內(nèi)靶向誘導(dǎo)舌鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞凋亡。

實(shí)驗(yàn)選用的毒素基因PE38KDEL是一種廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的非特異性分子細(xì)菌毒素PE的衍生物，屬于自殺基因，具有相對(duì)分子量較小、殺傷力強(qiáng)、免疫原性小的特點(diǎn)[13,14]。如何實(shí)現(xiàn)自殺基因靶向殺死腫瘤細(xì)胞是腫瘤基因治療的研究重點(diǎn)。前期實(shí)驗(yàn)根據(jù)SERPINB3基因在舌鱗狀細(xì)胞癌中被選擇性激活[15]，并且進(jìn)行體外細(xì)胞驗(yàn)證pSERPINB3-PE38KDEL毒素質(zhì)?？梢园邢蛞种芓CA8113細(xì)胞蛋白合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。再結(jié)合體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步證明SERPINB3啟動(dòng)子具有作為調(diào)控自殺基因靶向治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的毒素質(zhì)粒啟動(dòng)子的可行性。 本研究提示通過SERPINB3鱗癌特異性啟動(dòng)子調(diào)控下的PE38KDEL毒素表達(dá)質(zhì)粒對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌裸鼠皮下移植瘤的具有靶向治療的可能性，為建立腫瘤特異性基因調(diào)控自殺基因成為靶向毒素體系提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。