葉朋飛 劉靜 李秋達(dá) 周杰 黃杰秋 杜艷瓊

摘 要：目的：從自然發(fā)酵富源酸菜中分離乳酸菌，研究其益生特性，為乳酸菌益生菌制劑研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。方法：采集自然發(fā)酵的富源酸菜樣品，使用MRS培養(yǎng)基分離乳酸菌，研究其耐酸、耐膽鹽、抑菌活性和抗生素敏感性等益生特性，并采用16S rDNA基因序列分析法進(jìn)行鑒定。結(jié)果：分離得到MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2 4株菌株，16S rDNA序列分析結(jié)果表明，MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2分別為植物乳桿菌、戊糖乳桿菌、德氏乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌;與參考菌株鼠李糖乳桿菌LGG相比，戊糖乳桿菌MH-4和德氏乳桿菌ZY-3具有較強(qiáng)的耐受性和抑菌活性;抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，戊糖乳桿菌MH-4對(duì)氯霉素、紅霉素中度敏感，德氏乳桿菌ZY-3對(duì)氯霉素敏感、對(duì)紅霉素中度敏感。結(jié)論：從富源酸菜中分離得到植物乳桿菌、戊糖乳桿菌、德氏乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌4株乳酸菌，戊糖乳桿菌MH-4和德氏乳桿菌ZY-3具有顯著耐受性、抑菌活性和抗生素敏感性等益生特性，可作為微生態(tài)制劑候選菌株開展深層次研究。

關(guān)鍵詞：富源酸菜;乳酸菌;益生特性;抑菌活性;抗生素敏感性

Isolation， Identification and Probiotic Properties of Lactic Acid Bacteria from Fuyuan Sauerkraut

YE Pengfei， LIU Jing， LI Qiuda ， ZHOU Jie， HUANG Jieqiu， DU Yanqiong

（Department of Modern Agriculture， Qujing Vocational and Technical College， Qujing 655000， China）

Abstract： Objective： To provide basic data for the research and development of lactic acid bacteria probiotic preparations by isolating lactic acid bacteria from natural fermented Fuyuan sauerkraut and then studying its probiotic properties. Methods： MRS medium was used to isolate suspected lactic acid bacteria from samples of Fuyuan sauerkraut to study its probiotic properties， such as acid resistance， bile resistance， antibacterial activity and antibiotic sensitivity. And? 16SrDNA sequence analysis was also applied to identify the lactic acid bacteria above. Results： Four strains， MH-3， MH-4， ZY-3 and YS-2， were isolated. According to 16S rDNA sequence analysis， MH-3， MH-4， ZY-3 and YS-2 were identified as Lactobacillus plantarum， Lactiplantibacillus pentosus， Lactobacillus delbrueckii and Lactobacillus fermentum， respectively. Compared to the reference strain Lactobacillus rhamnosus LGG， both

L. pentosus MH-4 and L. delbrueckii ZY-3 showed greater tolerance and higher antimicrobial activity. Test results of antibiotic sensitivity showed that L. pentosus MH-4 was moderately sensitive to chloramphenicol and erythromycin， and L.delbrueckii ZY-3 was sensitive to chloramphenicol and moderately sensitive to erythromycin. Conclusion： Four LAB strains， Lactobacillus plantarum， Lactiplantibacillus pentosus， Lactobacillus delbrueckii and Lactobacillus fermentum were isolated from Fuyuan sauerkraut. Among them， L. pentosus MH-4 and? L. delbrueckii ZY-3， with better performance in probiotic properties， like tolerance， antimicrobial activity and antibiotic sensitivity， were proved to be candidates for further in-depth research for microecological preparations.

Keywords： Fuyuan sauerkraut; lactic acid bacteria; probiotic properties; antibacterial activity; antibiotic sensitivity

富源酸菜是云南省富源縣農(nóng)村常見的一種酸菜，以蘿卜、新鮮青菜、玉米面和水為原料，不添加其他原料，經(jīng)自然發(fā)酵等工藝制成的食品[1]。富源酸菜富含膳食纖維、鈣、磷、鐵和硒等營養(yǎng)物質(zhì)，具有健胃消食、減肥消暑、醒酒去膩等功效，因其特有的風(fēng)味受到人們的喜愛。2016年12月，富源酸菜協(xié)會(huì)成功將富源酸菜和富源酸菜豬腳火鍋制作技藝申報(bào)列為曲靖市非物質(zhì)文化遺產(chǎn)保護(hù)名錄。富源酸菜生產(chǎn)主要以家庭小作坊式為主，發(fā)酵過程大部分是在開放的環(huán)境中進(jìn)行的，參與自然發(fā)酵的微生物種類較多。目前，關(guān)于富源酸菜有益微生物資源的分離、鑒定及相關(guān)研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究從富源酸菜中分離鑒定乳酸菌并進(jìn)行益生特性研究，為挖掘、利用微生物資源，提升傳統(tǒng)發(fā)酵食品營養(yǎng)及功能品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

樣品采自云南省富源縣傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸菜。

1.1.2 指示菌和參考菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）CMCC44102、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）CMCC（B）50041、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri），上海保藏生物技術(shù)中心;鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試劑與儀器

MRS肉湯及瓊脂培養(yǎng)基、維生素C、石蠟油、膽鹽，索萊寶生物科技有限公司;革蘭氏染色劑，南京建成科技有限公司;厭氧產(chǎn)氣袋，MGC日本三菱有限公司;標(biāo)準(zhǔn)藥敏片，常德比克曼生物科技有限公司。

高壓滅菌鍋YX-18L-M，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;超純水儀，美國MILLIPORE公司;超低溫冰箱，ULT1386-3-V41 Thermo;渦旋混合器，江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠;微波爐M3-L236E金色，廣東美的廚房電器制造有限公司;單人單面凈化工作臺(tái)CJ-2D、生化培養(yǎng)箱SPX-70BⅢ，天津市泰斯特儀器有限公司;電子天平214A，上海豪晟科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

參照羅強(qiáng)等[2]方法，采集云南省富源縣農(nóng)家天然發(fā)酵酸菜樣品，用無菌移液器吸取混合均勻的酸菜汁液快速裝入30%的無菌甘油管中，置于采樣箱中，冰浴狀態(tài)下帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乳酸菌分離

將保存于30%甘油中的樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，按1%比例接種到添加0.1%抗壞血酸的MRS肉湯中，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)24 h，富集后將培養(yǎng)液梯度稀釋接種于1%碳酸鈣-MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑取菌落形態(tài)不同，并有明顯溶鈣圈的單菌落，純化3次后保存?zhèn)溆肹3]。

1.2.3 乳酸菌鑒定

（1）革蘭氏染色、接觸酶試驗(yàn)。將分離得到的菌株分別進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)、接觸酶測(cè)定試驗(yàn)鑒定。

（2）分子生物學(xué)鑒定。分離得到的4株疑似菌株委托安徽通用生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，測(cè)定序列后分析比對(duì)并通過clustalX 2.0和Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)分離得到菌株進(jìn)行鑒定[4]。

1.2.4 益生特性研究

（1）耐受性試驗(yàn)。①酸耐受試驗(yàn)。參照許強(qiáng)等[5]方法，接種單菌落于10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h，按5%比例接種到pH=2.0和pH=3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，在pH=2.0的條件下孵育1 h，在pH=3.0的條件下孵育3 h，用平板計(jì)數(shù)計(jì)算乳酸菌菌落數(shù)，并與參考菌株鼠李糖乳桿菌LGG比較。②膽鹽耐受試驗(yàn)。接種單菌落于10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h，按5%比例接種于不同膽鹽水平（0.1%和0.3%）的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，用平板計(jì)數(shù)計(jì)算乳酸菌菌落數(shù)，并與參考菌株鼠李糖乳桿菌LGG比較。

（2）對(duì)主要腸道致病菌的抑菌作用。參照鄒建華等[6]采用瓊脂打孔擴(kuò)散法研究菌株的培養(yǎng)上清液（pH值調(diào)整至6.2）對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和福氏志賀氏菌的抑制作用，并與參考菌株鼠李糖乳桿菌LGG比較。

（3）抗生素敏感性試驗(yàn)。參照鄒建華等[6]采用濾紙片擴(kuò)散法，分析4株乳酸菌的抗生素敏感性，試驗(yàn)用抗生素的種類、藥敏紙片含藥量及抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著者進(jìn)行Ducan’s多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，顯著水平設(shè)置為P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離、革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果

采用含碳酸鈣的MRS選擇性培養(yǎng)基從自然發(fā)酵富源酸菜中分離選出4株具有較強(qiáng)產(chǎn)酸能力的乳酸菌，編號(hào)分別為MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2。將分離得到的4株菌株進(jìn)行革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果見表2。4株菌株革蘭氏染色結(jié)果均為陽性，過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，初步判定為乳酸菌。

2.2 16S rDNA序列分析

2.2.1 序列的同源性分析

使用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST軟件，對(duì)分離、純化后4株菌株的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，MH-3與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的16S rDNA的相似性達(dá)99.63%，MH-4與戊糖乳桿菌（Lactiplantibacillus pentosus）的16S rDNA的相似性達(dá)99.55%，ZY-3與德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）的16S rDNA的相似性達(dá)99.93%，YS-2與發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）的16S rDNA的相似性達(dá)100.00%。

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

下載與分離菌株具有較近親緣關(guān)系的模式菌株16S rDNA序列，采用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示。MH-3與植物乳桿菌（L. plantarum）系統(tǒng)位置最近，MH-4與戊糖乳桿菌（L. pentosus）系統(tǒng)位置最近，ZY-3與德氏乳桿菌（L. delbrueckii）系統(tǒng)位置最近，YS-2與發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum）系統(tǒng)位置最近。綜合16S rDNA序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果，MH-3鑒定為植物乳桿菌（L. plantarum），MH-4鑒定為戊糖乳桿菌（L. pentosus），ZY-3鑒定為德氏乳桿菌（L. delbrueckii），YS-2鑒定為發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum）。

2.3 益生特性研究

2.3.1 耐受性試驗(yàn)

益生菌乳酸菌的重要特點(diǎn)是菌株應(yīng)具備一定的耐酸和耐膽鹽性能，以順利通過胃酸的消化作用進(jìn)入腸道發(fā)揮作用[7]。將分離、純化后的4株菌株分別在pH=3.0、pH=2.0、0.1%膽鹽、0.3%膽鹽條件下進(jìn)行處理，存活率如表4所示。結(jié)果顯示，與參考菌株鼠李糖乳桿菌LGG相比，MH-3、MH-4和ZY-3有較強(qiáng)的酸耐受性，YS-2酸耐受性較差;MH-4和ZY-3膽鹽耐受能力與參考菌株相當(dāng)。

2.3.2 對(duì)主要腸道致病菌的抑菌活性

益生菌乳酸菌發(fā)揮促進(jìn)腸道微生態(tài)平衡作用，關(guān)鍵益生性能是對(duì)腸道致病菌的抑菌活性。用4株菌株的培養(yǎng)上清液（pH值調(diào)整至6.2）研究對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和福氏志賀氏菌的抑制作用，結(jié)果見表5。MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和福氏志賀氏菌的抑制活性均顯著優(yōu)于參考菌株LGG。

2.3.3 抗生素敏感性試驗(yàn)

抗生素敏感性是評(píng)價(jià)益生菌安全性的重要指標(biāo)之一。本研究采用濾紙片擴(kuò)散法分析4株乳酸菌的抗生素敏感性?？股孛舾行缘呐卸▍⒄誄LSI最新版的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果見表6。MH-3、ZY-3和YS-2對(duì)氯霉素敏感，MH-4對(duì)氯霉素中度敏感;MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2對(duì)紅霉素中度敏感;MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2對(duì)四環(huán)素、萬古霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素和氨芐西林耐藥。

3 結(jié)論與討論

益生菌是一類攝入足夠量時(shí)對(duì)宿主機(jī)體健康有益的活性微生物的總稱[8]。大量研究證實(shí)，益生菌具有調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)平衡、促進(jìn)機(jī)體物質(zhì)代謝、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等益生特性，其保健功能越來越受關(guān)注[9]。目前，益生菌的主要種類包括乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌等。其中，乳酸菌是最主要的益生菌種類，在世界范圍內(nèi)被公認(rèn)為安全（Generally Recognized as Safe，GRAS）等級(jí)的食品微生物[10]。傳統(tǒng)發(fā)酵食品制作過程的實(shí)質(zhì)是富集、馴化與培養(yǎng)種類各異的微生物，這些微生物代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)造就了傳統(tǒng)發(fā)酵食品的獨(dú)特風(fēng)味與豐富營養(yǎng)[11]。國內(nèi)外已有許多研究致力于分離傳統(tǒng)發(fā)酵食品中具有抗菌、益生等功能的菌株。因此，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選益生特性較好的乳酸菌，在改善發(fā)酵食品風(fēng)味品質(zhì)、開發(fā)乳酸菌微生態(tài)制劑等方面具有較好的研究?jī)r(jià)值和開發(fā)前景。

自然發(fā)酵酸菜是我國的傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品，經(jīng)長(zhǎng)期的自然選擇和馴化，其中含有豐富的乳酸菌，是研究和開發(fā)有益菌群的天然寶庫[12]。許強(qiáng)等[5]從川西彝族酸菜汁中分離得到能耐受0.5%膽鹽濃度的環(huán)境、在pH=2和pH=3的環(huán)境中培養(yǎng)180 min后活菌數(shù)均大于106 CFU/mL的植物乳桿菌、副植物乳桿菌和副干酪乳桿菌。羅強(qiáng)等[2]從中國北方4個(gè)不同地區(qū)的20份傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜樣品中分離得到在pH=2.0條件下處理3 h存活率在70%以上的7株乳桿菌和2株腸球菌。龔加路等[13]從川南四市收集的9份農(nóng)家泡菜中分離得到1株對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌抑菌圈直徑達(dá)38.40 mm、16.50 mm，對(duì)0.3%～0.5%濃度膽鹽有良好耐受性的戊糖乳桿菌。李旭陽等[14]從寧夏銀川市采集的家庭自制的3份發(fā)酵泡菜中分離得到5株產(chǎn)酸較多的乳酸菌，其中瑞士乳桿菌NXU_19022的耐酸、耐膽鹽及生長(zhǎng)性能較好，在6 h左右優(yōu)先進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，其在pH為2時(shí)的存活率約為92%，在牛膽鹽含量百分比為0.9%時(shí)的存活率約為18%。XU等[15]從中國東北酸菜中分離的干酪乳桿菌NA-2可抑制蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌O157：H7的生長(zhǎng)。本研究從富源酸菜中分離得到MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2 4株乳酸菌，16S rDNA序列分析表明，MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2分別為植物乳桿菌、戊糖乳桿菌、德氏乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌。與參考菌株鼠李糖乳桿菌LGG相比，戊糖乳桿菌MH-4和德氏乳桿菌ZY-3具有較強(qiáng)的耐受性和抑菌活性;抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，戊糖乳桿菌MH-4對(duì)氯霉素、紅霉素中度敏感，德氏乳桿菌ZY-3對(duì)氯霉素敏感、對(duì)紅霉素中度敏感。因此，戊糖乳桿菌MH-4和德氏乳桿菌ZY-3擁有良好的耐受性、抗菌活性和抗生素敏感性，可作為微生態(tài)制劑候選菌株開展深層次研究。

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基金項(xiàng)目：曲靖職業(yè)技術(shù)學(xué)院教科研課題（2020YJKT002）。

作者簡(jiǎn)介：葉朋飛（1992—），男，云南曲靖人，碩士，助教。研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。