陶 毅，王凱飛，宋立成，付 晗，宋雨薇，薛少云，解立新 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 0085； 解放軍總醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)部，北京 0009； 張家口市肺科醫(yī)院，河北張家口 075000

根據(jù)世界衛(wèi)生組織2019年全球衛(wèi)生估計報告，下呼吸道感染是全球最致命的感染性疾病，也是2019年全球第四大死因[1]。對于下呼吸道感染，特別是醫(yī)院獲得性肺炎，最常見的感染病原體為細(xì)菌，包括鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等[2]。因此下呼吸道感染的診治首先要明確是否細(xì)菌感染。隨著纖維支氣管鏡的發(fā)展，支氣管肺泡灌洗逐漸被引入臨床實踐中[3-4]?；颊邔χ夤芊闻莨嘞茨褪苄院茫l(fā)癥相對較少。支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid，BALF)標(biāo)本又被稱為“液體活檢”，是在反映下呼吸道、遠(yuǎn)端氣道和肺泡生理病理狀態(tài)的同時提示可能感染病原體的珍貴標(biāo)本[5-6]。然而，由于支氣管肺泡灌洗操作過程中污染或環(huán)境細(xì)菌定植等原因，BALF中觀察到的細(xì)菌是否為感染病原體仍有待商榷。正常人BALF細(xì)胞分類中中性粒細(xì)胞≤3%，在難治性哮喘、慢性支氣管炎、特發(fā)性肺纖維化等疾病中，中性粒比例可升高。目前國內(nèi)外研究對于肺部細(xì)菌感染患者BALF中細(xì)胞比例特點尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[6-8]。因此，本研究回顧性總結(jié)肺部細(xì)菌感染患者BALF細(xì)胞分類特點，分析BALF分類計數(shù)中中性粒細(xì)胞比例對于下呼吸道細(xì)菌感染的診斷價值。

資料與方法

1 資料來源 選取 2018 年 1 月- 2020 年 12 月解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心送檢BALF細(xì)胞分類計數(shù)的患者資料。入選標(biāo)準(zhǔn)：1)性別不限，年齡≥18歲；2)曾行床旁支氣管肺泡灌洗并留取標(biāo)本送檢細(xì)胞分類計數(shù)；3)胸部CT提示肺部陰影。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)胸部CT提示肺間質(zhì)性病變；2)既往有血液系統(tǒng)疾??；3)BALF標(biāo)本質(zhì)量不合格：鱗狀上皮≥5%或柱狀上皮≥20%或BALF量少于5 mL；4)臨床病歷資料不完整。

2 BALF 細(xì)胞分類計數(shù)方法 1)按指南中推薦的標(biāo)準(zhǔn)流程采集BALF[8]，標(biāo)本送至實驗室后立即處理。先觀察并記錄灌洗液的性狀、顏色和總量，如含黏液成分，用無菌紗布過濾或0.1%二硫蘇糖醇溶解后處理；2)將上述BALF于4℃ 下 250 ~300 g離心10 min，留取上清液用作可溶性成分檢測，以 3 ~ 5 mL 0.9% 氯化鈉注射液重懸細(xì)胞沉淀制成細(xì)胞懸液；3)用計數(shù)板計算細(xì)胞總數(shù)，若細(xì)胞數(shù)過高，可用0.9%氯化鈉注射液稀釋調(diào)整為5×106/mL；4)將充分重懸的細(xì)胞懸液 50 μL 滴于載玻片上，載玻片冷風(fēng)干燥后，用蘇木精-伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE)染色；5)先在光學(xué)顯微鏡低倍視野(小于40×)下觀察整片，然后在高倍視野(40×及以上)下進(jìn)行細(xì)胞分類與計數(shù)，計數(shù)至少400個細(xì)胞。典型BALF標(biāo)本1 000倍油鏡下表現(xiàn)見圖1。

圖1 BALF標(biāo)本細(xì)胞分類1 000×油鏡下表現(xiàn)A：BALF標(biāo)本鏡下表現(xiàn)；B：質(zhì)量差的BALF標(biāo)本鏡下表現(xiàn)；C：肺部細(xì)菌感染患者BALF標(biāo)本鏡下表現(xiàn)；D：嗜酸性粒細(xì)胞肺炎患者BALF標(biāo)本鏡下表現(xiàn)Fig.1 The BALF cell patterns under 1 000× oil microscope A: cell pattern of qualified BALF specimen; B: cell pattern of unqualified BALF specimen; C: cell pattern of BALF specimen indicating pulmonary bacterial infection; D: cell pattern of BALF specimen indicating eosinophilic pneumonia

3 分組及分析指標(biāo) 根據(jù)患者最終臨床診斷分為細(xì)菌感染組與非細(xì)菌感染組。BALF細(xì)菌培養(yǎng)陽性、最終診斷為支原體、衣原體等非典型病原體及結(jié)核感染的肺炎患者可診斷為肺部細(xì)菌感染，根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)，結(jié)合影像學(xué)、實驗室病原學(xué)檢查以及抗菌藥物應(yīng)答情況判斷治療效果，明確患者最終臨床診斷。依據(jù)2018年中國成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南[2]，肺炎定義為胸部X線檢查或CT檢查顯示新出現(xiàn)的或進(jìn)展性的浸潤影、實變影或磨玻璃影，加上下列3種臨床癥狀中的2種或以上，可建立臨床診斷：1)發(fā)熱，體溫＞38℃；2)膿性氣道分泌物；3)外周血白細(xì)胞＞10×109/L或＜4×109/L。分析指標(biāo)：對兩組患者BALF中巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞比例進(jìn)行統(tǒng)計分析。

4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS23.0 統(tǒng)計軟件。正態(tài)計量資料以±s表示，組間比較采用成組t檢驗。偏態(tài)計量資料采用中位數(shù)Md(IQR)表示，組間比較采用成組秩檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或精確概率檢驗。采用ROC曲線分析BALF中性粒細(xì)胞比例對于肺部細(xì)菌感染的診斷價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 納入標(biāo)本的患者信息資料比較結(jié)果 納入141份標(biāo)本，其中細(xì)菌感染組109例，包括男性70例，女性39例，年齡(65±16)歲；非細(xì)菌感染組32例，其中男性22例，女性10例，年齡(61±17)歲，兩組患者性別、年齡、基礎(chǔ)疾病分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(表1)。最終診斷為肺部細(xì)菌感染109例，非細(xì)菌感染32例，其中非細(xì)菌感染組中，單純肺部真菌感染7例，支氣管擴(kuò)張1例，結(jié)節(jié)病1例，復(fù)發(fā)性多軟骨炎1例，肺淋巴管肌瘤病1例，哮喘1例，多漿膜腔積液1例，急性肺水腫1例，肺部陰影性質(zhì)不明18例。

表1 患者基線資料Tab.1 Baseline characteristics of the patients

2 兩組 BALF 細(xì)胞分類計數(shù)比較 細(xì)菌感染組中性粒細(xì)胞比例為47.0(25.7，86.1)%，非細(xì)菌感染組為9.6(3.7，26.1)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。同時兩組巨噬細(xì)胞比例、淋巴細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義，嗜酸性粒細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2 細(xì)菌感染組與非細(xì)菌感染組BALF細(xì)胞分類結(jié)果(%)Tab.2 BALF cell classification results of the bacterial infection group and the non-bacterial infection group (%)

3 中性粒細(xì)胞比例診斷肺部細(xì)菌感染的敏感度與特異性 進(jìn)一步探討中性粒細(xì)胞比例對肺部細(xì)菌感染的診斷效能。以細(xì)菌感染組109例為陽性樣本，以非細(xì)菌感染32例為陰性樣本，建立受試者工作特征曲線 (receiver operation characteristic，ROC)診斷分析模型。以軟件擬合之ROC曲線讀取約登指數(shù)最大值點，對應(yīng)計算理論閾值和各項參數(shù)。并按實測樣本計算敏感度、特異性、準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示： BALF中性粒細(xì)胞比例診斷肺部細(xì)菌感染的閾值為25%，敏感度為0.844，特異性為0.969，ROC曲線下面積為0.899(表3，圖2)。

表3 ROC分析結(jié)果Tab.3 ROC analysis results

圖2 中性粒細(xì)胞比例診斷肺部細(xì)菌感染ROC分析Fig.2 ROC analysis of neutrophil ratio in the diagnosis of pulmonary bacterial infection

討 論

肺炎主要分為社區(qū)獲得性肺炎與醫(yī)院獲得性肺炎，兩者在致病菌譜、潛在耐藥菌和多重耐藥菌感染風(fēng)險、抗菌藥物選擇等方面存在明顯差異[9]。社區(qū)獲得性肺炎的重要致病原為肺炎支原體和肺炎鏈球菌，而醫(yī)院獲得性肺炎常見的病原菌包括鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌等[2,10]。目前臨床常見的病原微生物檢測方法主要包括直接涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、免疫學(xué)和核酸檢測以及敏感度較高的宏基因組二代測序技術(shù)(metagenomics next generation sequencing，mNGS)[11]。而涂片鏡檢無法判斷鏡下細(xì)菌是感染還是定植或污染，分離培養(yǎng)、mNGS等所需時間較長(至少2 d)，無法第一時間指導(dǎo)危重癥患者治療方案，且常規(guī)革蘭染色和體液培養(yǎng)的陽性率一般低于60%，導(dǎo)致病情延誤，診斷不明確[12-14]。而BALF細(xì)胞分類計數(shù)2 ~3 h 內(nèi)即可完成。

本研究分析發(fā)現(xiàn)，相比于非肺部細(xì)菌感染組，細(xì)菌感染組BALF中性粒細(xì)胞比例顯著上升。通過ROC分析，中性粒細(xì)胞比例診斷肺部細(xì)菌感染的閾值為25%，ROC曲線下面積為0.899，具有較高的敏感度和特異性。符合國外文獻(xiàn)中BALF低中性粒細(xì)胞比例是排除呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的依據(jù)這一觀點[15]。

中性粒細(xì)胞升高對于肺部細(xì)菌感染有較強提示意義，但在包括難治性哮喘、慢性支氣管炎、特發(fā)性肺纖維化、石棉肺、急性呼吸窘迫綜合征等一系列疾病中，BALF中性粒細(xì)胞比例均可見升高。因此BALF中性粒細(xì)胞比例升高并不能作為診斷肺部細(xì)菌感染的唯一標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)BALF中性粒細(xì)胞比例高于25%時，提示存在肺部細(xì)菌感染的可能性大，同時必須結(jié)合患者臨床癥狀、影像學(xué)特點、既往病史等進(jìn)行綜合診斷。

本研究排除了近10%的質(zhì)量差標(biāo)本，提示臨床工作中須規(guī)范化肺泡灌洗操作才能獲得合格的下呼吸道標(biāo)本。目前大多數(shù)臨床實驗室在BALF的細(xì)胞學(xué)檢查中只報告細(xì)胞比例的差異，將微生物學(xué)、分子腫瘤學(xué)、細(xì)胞學(xué)交給微生物學(xué)、分子生物學(xué)和病理實驗室，檢查結(jié)果相對延遲，無法第一時間指導(dǎo)危重癥患者治療方案。因此，我們強調(diào)細(xì)胞學(xué)檢查同時應(yīng)研究異常成分，如真菌、細(xì)菌、腫瘤細(xì)胞等，即時的檢查結(jié)果可提高治療的充分性與及時性?？焖佻F(xiàn)場微生物學(xué)評價(microbiological rapid on-site evaluation，M-ROSE)是對下呼吸道標(biāo)本制片后通過迪夫快速染色、革蘭染色等進(jìn)行鏡下觀察和判讀[16-18]。目前我科經(jīng)多年努力建立的床旁病原學(xué)M-ROSE體系，能夠在半小時內(nèi)初步判定床旁下呼吸道標(biāo)本是否合格，并通過細(xì)胞學(xué)分類和炎性細(xì)胞內(nèi)病原體甄別初步判定是否存在感染以及感染的致病原，在較短時間內(nèi)完成BALF的細(xì)胞學(xué)與病原學(xué)初步分析[19]。未來，M-ROSE技術(shù)可能是改善BALF質(zhì)量，快速精準(zhǔn)診斷指導(dǎo)臨床重癥肺炎個體化治療和合理使用抗生素的關(guān)鍵。

綜上所述，BALF中性粒細(xì)胞比例超過25%對于肺部細(xì)菌感染有較強的提示價值，但仍需結(jié)合患者臨床癥狀、影像學(xué)特點、既往病史等進(jìn)行綜合評價。同時本研究為回顧性研究，仍需多中心前瞻性研究進(jìn)一步驗證。