邱敏華 楊守深,2 包銀莉,2 賴州文 黃藝珠 章 亮 黃翠琴,2＊

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 福建龍巖 364012；2.動(dòng)物源性人獸共患病防控福建省高校工程研究中心 福建龍巖 364012；3.龍巖新奧生物科技有限公司 福建連城 366215）

長期以來，飼用抗生素在保障動(dòng)物健康、促進(jìn)動(dòng)物生長、提高飼料利用率等方面取得明顯的效果，給畜禽生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。 但是也帶來一系列問題，如耐藥性、藥物殘留量和腸道內(nèi)菌群混亂等，受到社會的重視。我國畜禽源病大腸桿菌在耐藥率、耐藥水平上均顯著高于其它國家， 已成為耐藥性最為嚴(yán)重的國家之一[1]。 并且出現(xiàn)多重耐藥性的問題，繼續(xù)濫用抗生素只會使耐藥率不斷提高。目前，歐盟多個(gè)國家均禁止使用飼用抗生素， 中國對飼用抗生素的管理與應(yīng)用也更加嚴(yán)格，所以，開發(fā)代替抗生素的綠色飼料添加劑成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。 而丁酸自從被列入《添加劑品種目錄》后，漸漸被人們認(rèn)知，大量學(xué)者開始對丁酸進(jìn)行研究。

在飼料行業(yè)中，丁酸作為一種生物調(diào)節(jié)劑，可替代部分抗生素，起到酸化、電解質(zhì)平衡調(diào)節(jié)、胃腸道微生態(tài)平衡調(diào)節(jié)、誘食等作用[2]。 目前對丁酸的抑菌情況、作為添加劑及其添加劑量的報(bào)道相對較少，本試驗(yàn)通過測定丁酸對大腸桿菌生長曲線的影響，檢測丁酸能否抑制大腸桿菌的生長， 以醋酸對大腸桿菌生長曲線的影響作為對照， 為丁酸代替飼用抗生素的研究提供一些依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 純丁酸，由龍巖新奧生物科技有限公司贈(zèng)送；MH 瓊脂培養(yǎng)基、LB 肉湯、 麥康凱瓊脂，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；醋酸、大腸桿菌ATCC 25922、蒸餾水等。

1.2 大腸桿菌ATCC 25922 的復(fù)活 在超凈臺內(nèi)操作，將大腸桿菌ATCC 25922 凍干菌株啟封后，用接種環(huán)蘸取少量菌種到麥康凱培養(yǎng)基中， 待菌種溶解后分區(qū)進(jìn)行涂劃得到單菌落， 放入隔水式恒溫培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng)。 在麥康凱平板上挑選一個(gè)大腸桿菌ATCC 25922 單菌落， 接種到裝有3 mL LB肉湯的試管中， 放入37 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)4~6 h，長到生長對數(shù)期最佳。

1.3 藥液的配制 先用純丁酸、醋酸制備4%丁酸、醋酸母液。 分別吸取4%丁酸、 醋酸40 μL 加入到EP 管中，再加入960 μL 高壓過的蒸餾水，混勻后吸500 μL 到下一個(gè) EP 管中， 加入 500 μL 蒸餾水混勻，以此類推，得到濃度為 4%、2%、1%、0.5%、0.25%和0.125%的丁酸和醋酸。

1.4 抑菌試驗(yàn)

1.4.1 牛津杯試驗(yàn) 將牛津杯等試驗(yàn)用具高壓滅菌，放入電熱恒溫烘干箱烘干備用，在超凈臺內(nèi)將已滅菌的牛津杯置于培養(yǎng)皿中， 每個(gè)培養(yǎng)皿中放置4 個(gè)。MH 瓊脂培養(yǎng)基溫度降到 50 ℃時(shí)，將 MH 瓊脂培養(yǎng)基倒入燒杯中，加入 200 μL 菌液（1 000 倍稀釋），混勻后倒板，每個(gè)板約20 mL。 培養(yǎng)基凝固后，小心取出牛津杯，最后把濃度為4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%的丁酸、 醋酸加 100 μL 到對應(yīng)的牛津杯孔中，每個(gè)濃度制作一個(gè)平行。 靜置2 h 后，培養(yǎng)皿在37 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱中正放培養(yǎng)8~12 h， 培養(yǎng)好后觀察測量不同濃度丁酸、 醋酸的抑菌圈。

1.4.2 大腸桿菌OD 值測定 取不同量丁酸和醋酸加入LB 肉湯中，配成濃度為0.1%、0.075%、0.05%、0.025%的LB 肉湯，另做空白對照組。 在每瓶LB 肉湯中加入50 μL 大腸桿菌菌液(1 000 倍稀釋），混勻后吸取1.5 mL 到24 孔包被板中， 每個(gè)濃度做一個(gè)平行，全部加完后把24 孔包被板放入全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀測量OD 值，測完后立即放入37 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中進(jìn)行培養(yǎng)。 每隔1 h 使用全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀測量OD 值，24 h 后對所有結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并繪制成圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度丁酸、醋酸的抑菌圈 將濃度為4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%的丁酸、醋酸加入到牛津杯制作出來的孔中， 正置培養(yǎng)后測量抑菌圈直徑（見圖 1、表 1）。 濃度為 4%、2%、1%和 0.5%的丁酸、醋酸對大腸桿菌均有抑菌作用，其中4%丁酸、醋酸的抑菌效果最好， 抑菌圈直徑分別達(dá)到22 mm、28 mm，其余未出現(xiàn)明顯抑菌圈。 抑菌圈直徑隨著丁酸、醋酸濃度升高而明顯增大，相同濃度下醋酸的抑菌效果比丁酸好。

圖1 不同濃度丁酸和醋酸對大腸桿菌的抑菌圈

表1 各濃度丁酸和醋酸對大腸桿菌的影響

2.2 大腸桿菌的生長曲線圖 對濃度為0.1%、0.075%、0.05%、0.025%的丁酸和醋酸作用 24 h 的測量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制成圖（見圖2-圖3）。0.1%丁酸組的大腸桿菌生長極其緩慢，OD 值基本不變；0.075%丁酸組的大腸桿菌在19 h 前生長緩慢，20 h 開始輕微增長， 最終 OD 值約達(dá) 0.1；0.05%丁酸組的大腸桿菌生長明顯被推遲， 但是后期有明顯增長，OD 值接近對照組；0.025%丁酸組的OD 值增長趨勢與對照組相似， 大腸桿菌生長沒有受到明顯抑制，最終OD 值達(dá)約1.45。醋酸組與丁酸組結(jié)果相似，但在濃度為0.05%時(shí)有差距，醋酸組在該濃度沒有出現(xiàn)明顯對數(shù)生長期，且最終OD 值約0.85，僅為對照組的一半左右。 以上結(jié)果表明：丁酸、醋酸對大腸桿菌的生長均有抑制作用，且濃度越高，對大腸桿菌生長的影響越大。

圖2 丁酸作用下大腸桿菌的生長曲線

圖3 醋酸作用下大腸桿菌的生長曲線

3 討 論

本試驗(yàn)檢測了丁酸、 醋酸對大腸桿菌ATCC 25922 的抑制效果。試驗(yàn)參考張含薇等[3]采用的牛津杯法，先把菌液加入MH 瓊脂培養(yǎng)基中混勻，再進(jìn)行倒板，沒有采用傳統(tǒng)的先倒板再用涂布器涂布菌液，減少了涂布器涂布不均勻或者涂布過厚引起的誤差。 培養(yǎng)8~12 h 后可以看到細(xì)菌分布均勻，濃度為4%、2%、1%和0.5%的丁酸、 醋酸有明顯的抑菌圈，由結(jié)果可知丁酸與醋酸一樣對細(xì)菌都有一定的抑制作用，并且濃度越高抑菌效果越好。不同濃度丁酸的抑菌圈直徑分別為 4%（22 mm）、2%（18 mm）、1%（13 mm）、0.5%（9 mm）， 證實(shí)了丁酸對大腸桿菌的生長有抑制作用， 且濃度越高抑制效果更佳。 使用全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀對細(xì)菌菌液進(jìn)行OD 值測定，繪制生長曲線， 結(jié)果表明丁酸和醋酸對大腸桿菌的生長曲線具有一定的影響， 并且隨著濃度的升高影響更明顯，濃度為0.1%時(shí)影響最大，基本上抑制了大腸桿菌的生長。

短鏈脂肪酸主要有乙酸、丙酸和丁酸，本試驗(yàn)測定了丁酸、醋酸對大腸桿菌生長曲線的影響，發(fā)現(xiàn)丁酸和醋酸對大腸桿菌生長曲線均有影響， 在牛津杯試驗(yàn)中也都產(chǎn)生明顯的抑菌圈， 同等濃度下醋酸的抑菌圈會稍微大些。 在短鏈脂肪酸中丁酸起主要作用，丁酸既溶于水也溶于脂類，總體來說比較親脂，在pH4~6 的酸性環(huán)境下也很難被分解，所以，丁酸被動(dòng)物攝入后可以避過小腸的酸性環(huán)境， 進(jìn)入動(dòng)物的盲腸、結(jié)腸中繼續(xù)發(fā)揮其重要作用。 對肉雞、仔豬的研究也表明，丁酸能夠降低腸道pH，使腸道的環(huán)境變成適合乳酸菌等有益菌生長的酸性環(huán)境， 添加酸化劑可以使動(dòng)物腸道中乳酸桿菌的數(shù)量增加，降低大腸桿菌的數(shù)量， 使腸道的微生物區(qū)系得到優(yōu)化[4-5]。 使用高脂飼料喂小鼠，結(jié)果顯示丁酸鈉可以使小鼠失調(diào)的腸道微生態(tài)得到恢復(fù)， 從而減少脂肪肝的發(fā)生[6]。 丁酸具有游離性和揮發(fā)性，因此，飼料生產(chǎn)中一般將丁酸制成穩(wěn)定的鈉鹽-丁酸鈉， 丁酸鈉的流動(dòng)性較好，無污染、無殘留，易與其它飼料混合，而且不會改變飼料的pH，將來在飼料工業(yè)上必能發(fā)揮更好的作用。

仔豬在斷乳后的2 d 內(nèi)， 回腸乳酸菌數(shù)量急劇下降，大腸桿菌數(shù)量明顯增加，導(dǎo)致仔豬容易患大腸桿菌病。為了減少仔豬腹瀉，常在斷乳仔豬飼料中加入高劑量氧化鋅， 高鋅飼料能夠在早期斷乳仔豬生長性能及防止腹瀉方面起到顯著的效果。 張文麗[7]報(bào)道在仔豬飼料中加入高劑量氧化鋅， 能夠在一定程度上促進(jìn)仔豬的生長速度并提高仔豬的日采食量。 王超[8]通過試驗(yàn)證實(shí)在生長早期仔豬飼料中添加高劑量鋅可以促進(jìn)仔豬的生長。 但長期使用高鋅飼料，會造成豬肉質(zhì)量下降、豬肉中的鋅殘留量會過高。 所以，在飼料行業(yè)中，很多研究者嘗試用丁酸鈉代替高劑量氧化鋅，并取得一定效果。 Manzanilla E G 等[9]在早期斷乳仔豬日糧中加入0.1%丁酸鈉，可以大大降低腹瀉率，尤其是斷乳后7 d。 大量研究表明，使用丁酸鈉代替飼料中的高劑量氧化鋅，能夠大大降低斷乳仔豬腹瀉的發(fā)生， 還可以增強(qiáng)斷乳仔豬的抵抗力，提高斷乳仔豬的采食量，促進(jìn)斷乳仔豬快速生長，提高斷乳仔豬的健康水平。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)表明，丁酸與醋酸類似，具有一定的抑菌效果，不同濃度產(chǎn)生的抑菌作用各不相同，藥物濃度越高，影響越大。丁酸鈉濃度達(dá)0.1%時(shí)，對大腸桿菌的生長曲線影響最大， 大腸桿菌的生長基本受到抑制，因此，可以通過在飼料中添加丁酸鈉達(dá)到抑制細(xì)菌的目的，為應(yīng)用飼料添加劑抑制細(xì)菌提供參考。