吳麗蘭 兆豐華生物科技(福州)有限公司 福州 350014

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是危害養(yǎng)豬業(yè)的一個(gè)重大傳染病，傳播能力強(qiáng)，主要引起母豬的繁殖障礙， 仔豬斷乳前后高病死率以及育成豬的呼吸道疾病[1]。 該病主要是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的病毒性疾病，可通過(guò)空氣傳播，引起免疫抑制和繼發(fā)感染造成豬群的不穩(wěn)定， 給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大損失。目前，弱毒疫苗能夠產(chǎn)生較好的細(xì)胞免疫，有效抵抗同源或相近的PRRSV 野毒感染，降低豬場(chǎng)發(fā)病率及穩(wěn)定控制豬場(chǎng)疫情。 在弱毒疫苗生產(chǎn)中，抗原收獲是決定疫苗質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)比PRRSV 抗原收獲時(shí)上清液與細(xì)胞液之間的病毒含量差異以及凍干后的病毒含量，篩選出較為優(yōu)勢(shì)的抗原收獲方式。

1 材 料

1.1 毒種 PRRSV（CH-1R 株），購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 細(xì)胞 Marc-145 細(xì)胞克隆株，兆豐華生物科技（福州）有限公司自主篩選。

1.3 試劑 MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰酶，購(gòu)自Gibco 公司；胎牛血清，購(gòu)自蘭州榮曄生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器設(shè)備 SAYO 二氧化碳培養(yǎng)箱、 倒置相差顯微鏡、GLZ-18 型凍干機(jī)、 漩渦型振蕩器、 轉(zhuǎn)瓶機(jī)等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞制備 選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期形成致密單層的Marc-145 細(xì)胞， 用0.25%胰酶-EDTA 溶液將細(xì)胞消化分散成細(xì)胞懸液， 按1:3 比例進(jìn)行細(xì)胞分種， 用含胎牛血清和MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞接毒 待細(xì)胞培養(yǎng)52 h 長(zhǎng)成致密單層后，挑選細(xì)胞，將細(xì)胞分為 A、B、C、D、E 五組，每組2 瓶（每組中的2 瓶細(xì)胞必須由同一個(gè)母瓶傳出，分種率一樣，細(xì)胞長(zhǎng)滿后肉眼看幾乎無(wú)差異）。 棄去細(xì)胞所有的培養(yǎng)液，將PRRSV（CH-1R 株）按1%接種量接種，補(bǔ)足MEM 維持液。 置溫室于37 ℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)速為同一固定值。

2.3 抗原收獲

2.3.1 收獲時(shí)間 分5 個(gè)時(shí)間段收獲抗原。 A 組收獲時(shí)間較B 組提前4 h，B 組收獲時(shí)間為抗原含量最高的時(shí)間點(diǎn) （依據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)獲得）；C 組收獲時(shí)間較 B 組往后 4 h；D 組收獲時(shí)間較 B 組往后 8 h，E組收獲時(shí)間較B 組往后12 h（見(jiàn)表1）。每組又分為-1 和-2， 例如 A-1 代表 A 組上清液，A-2 代表 A 組細(xì)胞液。

表1 分組與收獲時(shí)間

2.3.2 收獲上清液 A-1、B-1、C-1、D-1、E-1 這5 組細(xì)胞到達(dá)預(yù)定收獲時(shí)間后，輕輕搖晃細(xì)胞瓶，將病毒液分別收集到已滅菌的瓶中，取樣、測(cè)定樣品的病毒含量。

2.3.3 收獲細(xì)胞液 將 A-2、B-2、C-2、D-2、E-2 這5 組細(xì)胞在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)收獲， 放入-20 ℃冷庫(kù)凍結(jié)， 第2 d 利用已經(jīng)結(jié)冰的病毒液將瓶壁的細(xì)胞刮下來(lái)，待病毒液全部融化后，連同細(xì)胞一起收獲，取樣、測(cè)定樣品的病毒含量。

2.3.4 凍干 將收獲的 A-1、A-2、B-1、B-2、C-1、C-2、D-1、D-2、E-1、E-2 這 10 份樣品配苗，加入明膠蔗糖凍干保護(hù)劑進(jìn)行真空冷凍干燥。 取凍干完成的樣品，測(cè)定樣品病毒含量。

2.4 病毒含量測(cè)定 用MEM 維持液將每個(gè)待檢樣品作 10 倍系列稀釋?zhuān)?取 10-5、10-6、10-7、10-8四個(gè)梯度稀釋液接種單層的Marc-145 細(xì)胞， 置37 ℃培養(yǎng)5 d，按 Reed-Muench 法計(jì)算 TCID50[2]。

3 結(jié) 果

3.1 上清液與細(xì)胞液病毒含量差異 A、B、C、D、E五組，按不同的收獲方式分別收取上清液及細(xì)胞液，進(jìn)行病毒含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。A 組和D 組上清液病毒含量略低于細(xì)胞液，B 組和E 組上清液病毒含量略高于細(xì)胞液，C 組上清液病毒含量與細(xì)胞液相同，通過(guò)分析上清液與細(xì)胞液病毒含量可知，兩種收獲方式獲得的病毒含量差異不顯著（P>0.05）。

表2 不同收獲方式的病毒含量差異情況

3.2 上清液與細(xì)胞液凍干后病毒含量差異 A、B、C、D、E 五組 10 份樣品凍干后，取樣，測(cè)病毒含量，結(jié)果見(jiàn)表3。 B、C、E 三組凍干后的上清液病毒含量略高于凍干后的細(xì)胞液，D 組凍干后的上清液病毒含量略低于凍干后的細(xì)胞液，A 組則相同。通過(guò)分析上清液與細(xì)胞液凍干后的病毒含量可知， 凍干后效價(jià)差異不顯著（P>0.05）。

表3 上清液與細(xì)胞液凍干后病毒含量差異

4 小結(jié)與討論

在試驗(yàn)中， 為了證明上清液與細(xì)胞液之間的病毒含量差異不是在某一個(gè)點(diǎn)， 因此設(shè)計(jì)了病變具有代表性的5 個(gè)收獲時(shí)間點(diǎn)。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在收獲抗原時(shí)，無(wú)論是收獲上清液還是細(xì)胞液，它們之間的病毒含量差異并不顯著。 有文獻(xiàn)表明，PRRSV 的復(fù)制在胞漿中進(jìn)行，在感染一定時(shí)間后，病毒粒子在細(xì)胞囊泡中成熟，并運(yùn)輸?shù)綕{膜，通過(guò)細(xì)胞胞吐作用外排子代病毒[3]，所以，上清液中的病毒含量也是隨著病毒的繁殖規(guī)律相應(yīng)變化的。

雖然上清液與細(xì)胞液效價(jià)差異不顯著， 但是從它們的凍干制品還是可以看出上清液凍干后病毒含量總體會(huì)略高于細(xì)胞液， 可能是由于兩者的收獲方式不同造成的。 PRRSV 是一種有囊膜的病毒，在環(huán)境中不穩(wěn)定[2]。 只收獲上清液時(shí)，操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短、凍損少。收獲細(xì)胞液時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的一些病毒在收獲時(shí)不是完全成熟的，而且收獲操作過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，增加了一次凍融，導(dǎo)致在凍干過(guò)程中耗損更大。這也是為什么細(xì)胞液的病毒含量不會(huì)每次都高于上清液的原因。

抗原只收獲上清液， 不需要經(jīng)過(guò)細(xì)胞凍融與刮苗這兩道工序，可以減少相應(yīng)的人力成本，減少冷庫(kù)的面積，提高細(xì)胞瓶的周轉(zhuǎn)頻率，減少抗原的耗損，提高生產(chǎn)效率，幾乎剔除了大部分細(xì)胞碎片，減少動(dòng)物的臨床過(guò)敏反應(yīng)幾率。鑒于以上結(jié)果，筆者認(rèn)為收獲上清液比收獲細(xì)胞液在抗原的生產(chǎn)中更具優(yōu)勢(shì)。