王 燕 周建華 俞春英 楊燕燕 謝金東 鐘秋明 王訓立

（福建中醫(yī)藥大學 福州 350122）

在臨床上，環(huán)磷酰胺作為抗腫瘤藥物，廣泛應用于惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、小細胞肺癌、卵巢癌、神經母細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤以及急性白血病和慢性淋巴細胞白血病等疾病的治療。 但過量使用時，會產生劑量依賴性的毒性臨床表現(xiàn)[1]。 環(huán)磷酰胺除了用于抗腫瘤藥物治療外， 也是常用的免疫抑制劑，因其價格低廉、效果良好而被廣泛應用[2]。環(huán)磷酰胺在體內代謝過程中， 不僅直接作用于細胞產生嚴重的毒性作用，還對肝臟、腎臟、胸腺、脾臟等器官有明顯的損傷， 人們也常常利用環(huán)磷酰胺的毒副作用，制備免疫抑制動物模型，獲得良好的免疫抑制效果，從而用于不同目的的科學探索試驗[3-4]。

本試驗采用福建特有的家兔品種福建黃兔作為試驗對象，通過注射不同劑量的環(huán)磷酰胺，觀察其對福建黃兔肝、腎造成的損傷程度，為用環(huán)磷酰胺制備福建黃兔動物免疫抑制模型提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 雌性福建黃兔18 只，體重2.0～2.4 kg，福建省連江玉華山自然生態(tài)農業(yè)試驗場提供。

1.2 主要試劑與儀器 環(huán)磷酰胺、分化液、返藍液購自上海源葉生物有限公司； 多聚甲醛購自蘭杰柯擴建有限公司； 滅菌生理鹽水購自福州海王福藥制藥有限公司； 酒精和二甲苯購自天津永大試劑有限公司；蘇木素染液、伊紅染液、中性樹膠由中杉金橋公司提供； 石蠟由北京北化康泰臨床試劑有限公司提供（熔點 56～58 ℃）。

光學顯微鏡產自日本奧林巴斯公司 （型號：BX51T-PHD-J11）； 多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(tǒng)由美國Media Cybernetics 公司提供 （型號：Image-Pro Plus）； 石蠟切片機為德國萊卡生產 （型號：RM2015）；電熱恒溫干燥箱購自上海一恒科學儀器有限公司（型號：DHG-9053A）；低溫冰箱由美國賽默飛世爾科技公司生產（型號：HFU586）；移液器購自德國EPPENDOR 公司；恒溫水浴箱由江蘇太倉醫(yī)用儀器廠生產（型號：DSHZ-300）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗動物及分組 18 只雌性福建黃兔飼養(yǎng)于普通級兔實驗室，自由采食和飲水，黃兔購進后在福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心動物實驗室適應性喂養(yǎng)7 d，隨機分成6 組，分別為對照組和劑量組Ⅰ～Ⅴ， 每組3 只。 劑量組分別按環(huán)磷酰胺濃度20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg、80 mg/kg、100 mg/kg 腹腔注射，對照組腹腔注射滅菌生理鹽水2 mL。 連續(xù)給藥7 d，第8 d 解剖取材。 動物試驗期間，嚴格按照普通級實驗兔飼養(yǎng)管理標準操作規(guī)程。

1.3.2 試驗動物行為觀察 試驗給藥前和給藥結束后第2 d 分別對動物稱重。 試驗過程觀察動物的飲食、精神、外觀、行為等狀況。

1.3.3 樣品采集及預處理 采樣前12 h，動物禁食不禁水。 30%烏拉坦注射液（3.5 mL/kg 體重）耳靜脈麻醉黃兔，解剖摘取肝臟、腎臟組織，剔除組織表面脂肪和附著物，生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干，再修成3～5 mm3近方形組織塊， 置于4%多聚甲醛溶液固定，并在4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 石蠟切片制備流程 按常規(guī)石蠟切片制作技術，將樣品（肝臟、腎臟組織）放入包埋盒內，在自來水下沖洗1 h；使用梯度乙醇常規(guī)脫水，即用75%、80%、95%、95%、100%、100%乙醇分別處理 1 h，然后分別在二甲苯Ⅰ中處理25 min 和二甲苯Ⅱ中處理25 min；將樣品放入包埋模中，用石蠟封住，放入冷臺待其冷卻后取出； 取出包埋后的蠟塊， 切片機切成 4～5 μm 厚的蠟片， 烘烤切片， 用二甲苯脫蠟處理。

1.3.5 H.E 染色操作流程 石蠟切片二甲苯脫蠟10 ～30 min → 無 水 乙 醇 Ⅰ 5 min → 無 水 乙 醇 Ⅱ5 min→95%乙醇Ⅰ 5 min、 Ⅱ 5 min→80%乙醇5 min→70%乙醇5 min→水洗1 min→Harris 蘇木素液1～3 min→水洗→0.5%鹽酸酒精分化液分化3～10 s→水洗→返藍液反藍5～10 min （注意觀察顏色變化）→水洗1～3 min→伊紅染液 3～5 min→95%乙醇Ⅰ 1 min、 Ⅱ 5 min →無水乙醇Ⅰ 5 min、Ⅱ5 min→二甲苯透明20～30 min→中性樹膠封片。

1.4 數(shù)據(jù)分析 試驗所得數(shù)據(jù)用x±s 表示， 使用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)比較；肝臟、腎臟組織石蠟切片，采用顯微成像分析系統(tǒng)（CCD）進行拍照分析。

2 結果與分析

2.1 不同劑量環(huán)磷酰胺對黃兔體重、 行為的影響試驗給藥前和給藥結束后第2 d 分別對動物稱重，對照組注射前后黃兔體重（增加）差異極顯著（P<0.01）。 給藥組隨著環(huán)磷酰胺注射劑量升高，體重下降越趨明顯， 環(huán)磷酰胺濃度為20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg 時， 注射前后黃兔體重無明顯差異 （P>0.05）；環(huán)磷酰胺濃度為80 mg/kg 時，注射前后黃兔體重（減輕）有顯著差異（P<0.05）；環(huán)磷酰胺濃度為100 mg/kg 時，注射前后黃兔體重（減輕）差異極顯著（P<0.01），見表 1。

表1 不同劑量環(huán)磷酰胺對黃兔體重的影響

2.2 不同劑量環(huán)磷酰胺對福建黃兔肝臟組織結構的影響 福建黃兔肝臟組織H.E 染色觀察結果：與對照組（見圖1A）相比，劑量組Ⅰ（環(huán)磷酰胺注射濃度為20 mg/kg）的肝臟組織結構沒有變化，其中肝索結構輪廓清晰，肝血竇形態(tài)正常，肝細胞分布、著色均勻，門管區(qū)結構顯示正常（見圖1B）。劑量組Ⅱ（環(huán)磷酰胺注射濃度為40 mg/kg） 可見局部肝細胞出現(xiàn)輕度水腫和變性， 但未見有壞死和明顯的炎癥反應現(xiàn)象（見圖1C）。劑量組Ⅲ（環(huán)磷酰胺注射濃度為60 mg/kg）的肝細胞索結構稍紊亂，局部肝細胞水腫變性，散在小片狀肝細胞嗜酸性變，細胞核固縮或溶解（見圖1D）。 劑量組Ⅳ（環(huán)磷酰胺注射濃度為80 mg/kg）的肝細胞索排列紊亂，大量肝細胞呈現(xiàn)水腫和空泡化病灶，產生小片狀變性壞死，肝血竇出現(xiàn)擴張淤血，多見枯否細胞的現(xiàn)象（見圖1E）。劑量組Ⅴ（環(huán)磷酰胺注射濃度為100 mg/kg）有大量肝細胞呈嗜酸性病變，出現(xiàn)大面積凝固性壞死（見圖1F）。

圖1 不同劑量環(huán)磷酰胺對福建黃兔肝臟組織結構的影響

2.3 不同劑量環(huán)磷酰胺對福建黃兔腎臟組織結構的影響 與對照組（見圖2A）相比，劑量Ⅰ組的腎臟組織沒有明顯變化， 腎小球和腎小管上皮細胞也沒有發(fā)現(xiàn)明顯變化（見圖2B）。劑量組Ⅱ出現(xiàn)腎小管上皮輕度變性， 腎間質也呈現(xiàn)輕度水腫現(xiàn)象 （見圖2C）。 劑量組Ⅲ腎小管上皮發(fā)生變性，腎間質出現(xiàn)明顯水腫，有大量滲出液淤積，炎癥細胞發(fā)生浸潤現(xiàn)象（見圖2D）。 劑量組Ⅳ大量腎小管上皮變性，管壁明顯變薄，管腔變大，腎間質呈現(xiàn)嚴重水腫、出血病癥，腎小囊間隙明顯變?。ㄒ妶D2E）。劑量組Ⅴ出現(xiàn)大量腎小管上皮細胞壞死、脫落現(xiàn)象，腎小管壁變薄，管腔擴張，間質表現(xiàn)水腫、滲出，大量腎小球缺血、萎縮（見圖 2F）。

圖2 不同劑量環(huán)磷酰胺對福建黃兔腎臟組織結構的影響

3 討 論

不同品種品系的試驗動物， 應用環(huán)磷酰胺制備免疫抑制動物模型， 其給藥途徑和給藥劑量有所不同，對動物造成的損傷也存在差異。環(huán)磷酰胺在生物體內的代謝過程中， 在肝臟經肝細胞色素P450 酶系水解的主要物質有磷酰胺氮芥和丙烯醛[5-7]。 磷酰胺氮芥具有抗腫瘤作用， 而丙烯醛對機體的毒副作用較大，抑制機體骨髓生成以及造成生殖系統(tǒng)、肝臟和腎臟等器官、組織損傷[8]。 環(huán)磷酰胺對肝臟的損傷主要是可引起肝細胞壞死，肝小葉中心出現(xiàn)充血，并伴隨氨基轉移酶升高[9]。 付晶等[10]發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺可導致雛雞肝臟組織細胞內線粒體明顯受損， 并發(fā)生細胞凋亡現(xiàn)象。 王怡菲等[11]報道環(huán)磷酰胺制備免疫抑制動物模型時，不僅對肝臟產生損傷，腎臟病變主要表現(xiàn)為不同程度的纖維增生和出血現(xiàn)象， 細胞空泡化和核固縮等。

外觀體征行為觀察發(fā)現(xiàn)， 環(huán)磷酰胺高劑量組（80 mg/kg、100 mg/kg）給藥后期，動物精神萎靡、呆滯，食欲下降，體重明顯下降，出現(xiàn)明顯的肝腎受損癥狀， 如血尿； 環(huán)磷酰胺中劑量組 （40 mg/kg、60 mg/kg） 給藥后期， 動物有出現(xiàn)食欲輕微下降現(xiàn)象，個別動物有血尿現(xiàn)象，表明肝腎受損；環(huán)磷酰胺低劑量組（20 mg/kg）及對照組動物精神狀況、食欲未出現(xiàn)明顯的反應。由此可見，不同劑量環(huán)磷酰胺對福建黃兔體重、行為等有顯著的影響。

本試驗結果表明， 不同劑量環(huán)磷酰胺可造成福建黃兔肝腎組織不同程度的損傷。 隨著環(huán)磷酰胺注射劑量的不同，病變程度不同，即肝臟、腎臟組織的病變程度與環(huán)磷酰胺的注射劑量成正相關。 低劑量（20 mg/kg）環(huán)磷酰胺對福建黃兔肝腎組織形態(tài)無明顯影響，高劑量（80 mg/kg 及以上）環(huán)磷酰胺可誘導福建黃兔肝細胞變性，嚴重壞死，同時可導致腎小管上皮變性，腎間質水腫、滲出，腎小管上皮壞死脫落，腎小球呈現(xiàn)缺血、萎縮等癥狀；二者病變均隨劑量增加而加重。

該研究結果可為用環(huán)磷酰胺制備福建黃兔動物免疫抑制模型提供參考依據(jù)。