陳維怡，王玥珠，蘇 怡，沈戀迪，蔡徐山，張麗峰，楊鳳云，喇雪娜,6，陳 安，程 路，蔣 泓

（1.復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院婦幼與兒少衛(wèi)生教研室，上海 200032；2.國家衛(wèi)生健康委員會衛(wèi)生技術(shù)評估重點實驗室，公共 衛(wèi)生安全教育部重點實驗室，復(fù)旦 大學(xué)，上海 200032；3.上海市生物醫(yī)藥技術(shù)研究院，上海 市疾病與健康基因組學(xué)重點實驗室，上海 201203；4.復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院口腔科，上海 200031；5.上海市嘉定區(qū)婦幼保健院，上海 201821；6.上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336；7.阿爾托大學(xué)醫(yī)療服務(wù)管理研究中心，艾斯 波 02150，芬蘭 ；8.阿爾托大學(xué)計算機(jī)系，艾斯 波 02150，芬蘭 ）

口腔是一個復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境，約有多達(dá)700 余種細(xì)菌、病毒和真菌等微生物[1]，多種微生物相互作用，以維持口腔生態(tài)系統(tǒng)平衡。然而，口腔中菌群失衡可能導(dǎo)致牙周病、齲齒等口腔疾病的發(fā)生[2]。牙周病是一種牙周組織的慢性炎癥性疾病，是成年人中最常見的炎癥性疾病之一[3]。有研究證據(jù)表明，牙周病可能對全身性疾病如動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及不良妊娠結(jié)局的發(fā)生和發(fā)展有潛在影響[4-6]。了解牙周病患者的口腔菌群結(jié)構(gòu)特征及與健康人的差異是深入探究牙周病對全身性疾病影響的前提，但已有的研究大多從人群水平上分析了牙周病與系統(tǒng)性疾病的關(guān)聯(lián)，迄今為止從菌群角度關(guān)注牙周病與系統(tǒng)性疾病，分析牙周病患者與牙周健康者口腔菌群差異的研究相對較少，其中對孕前或孕期女性牙周病的研究尤為缺乏。而目前大量研究已顯示了牙周病與妊娠期糖尿病、先兆子癇、早產(chǎn)低出生體重等不良妊娠結(jié)局顯著關(guān)聯(lián)[6]，但是一些在孕期開展的牙周病診治以改善不良妊娠結(jié)局的隨機(jī)對照研究，并未顯示這樣的干預(yù)能顯著降低不良妊娠結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險。因此有研究者提出，妊娠期由于安全原因往往無法開展充分的治療，牙周病治療本身有可能誘導(dǎo)一過性菌血癥，進(jìn)一步加重不良妊娠結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險，因而以改善妊娠結(jié)局為目的的牙周病診治應(yīng)當(dāng)提前到孕前期[7]。

因此，本研究招募備孕中的孕前婦女，為其提供口腔檢查并了解牙周病患病信息，同時采用16S rDNA 高通量測序分析患有牙周病的孕前婦女和牙周健康孕前婦女口腔唾液菌群的群落構(gòu)成和特征，并通過差異菌群研究探索患有牙周病的婦女口腔中主要存在的差異微生物組，為進(jìn)一步探索牙周病與不良妊娠結(jié)局關(guān)聯(lián)的機(jī)制提供依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究設(shè)計

本研究基于復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院孕前隊列[8]（Preconceptional Offspring Trajectory Study，POTS），該隊列自2016 年起在上海市嘉定區(qū)婦幼保健院招募計劃備孕的孕前夫婦，跟蹤隨訪至分娩。本研究采取病例對照研究設(shè)計。

1.2 研究對象

選取自2016 年10 月至2019 年6 月招募的計劃備孕的育齡孕前婦女為研究對象，選取58 例患有牙周病和60 例牙周健康的孕前婦女進(jìn)行比較分析，共收集到118 份孕前婦女非刺激性唾液樣本。本研究的納入標(biāo)準(zhǔn)為：①全口余留牙數(shù)＞20 顆；②唾液樣本采集前30 天內(nèi)未接受過牙周治療，未使用過任何可能造成牙齦反應(yīng)的藥物；③無免疫缺陷、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等全身系統(tǒng)疾?。虎茉敢鈪⒓用赓M提供的口腔檢查和唾液樣本采集。

1.3 研究方法

1.3.1 問卷調(diào)查與質(zhì)量控制

通過孕前基線問卷收集研究對象的體格測量數(shù)據(jù)及一般人口學(xué)特征，包括年齡、身高、孕前體重、家庭人均年收入、受教育程度等信息，利用醫(yī)療系統(tǒng)記錄獲取孕產(chǎn)史等信息。所有現(xiàn)場調(diào)查人員均經(jīng)過統(tǒng)一的培訓(xùn)，負(fù)責(zé)問卷調(diào)查、數(shù)據(jù)錄入和質(zhì)量控制工作。

1.3.2 牙周探查

為每一位孕前婦女提供免費的口腔檢測，方法如下：使用鈍頭帶刻度的牙周探針，探診時探針與牙長軸平行，尖端緊貼牙面，探入牙周袋底后記錄從袋底到齦緣的距離（mm），即探診深度。探診后記錄探診過程中是否出血及出血位點[9]。牙周病判斷標(biāo)準(zhǔn)：存在至少1 個位點，牙周附著水平≥4mm，牙周袋深度≥4mm，則判定為牙周病[10]，歸入牙周病組；若所有牙位牙周袋深度小于3mm，牙周附著水平＜2mm，且沒有探針出血、紅腫則判定為牙周健康[11]，歸入牙周健康組。

1.3.3 唾液樣本采集

要求研究對象采集前30min 不進(jìn)食、飲水、吸煙或嚼口香糖，采集時先用清水漱口，待5min 后將非刺激性唾液吐至無菌離心管中，并且要求每次吐出唾液時需保持唾液在口中持續(xù)至少1min，過程持續(xù)直至收集到唾液滿3～5mL 為止。唾液收集后靜置沉淀4h 后，留取上清液進(jìn)行分裝，并置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 唾液DNA 提取、高通量測序與質(zhì)控

抽提基因組DNA 之后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的DNA。本研究選用帶有barcode(樣品標(biāo)簽，用于在混池測序后區(qū)分序列來自哪個樣本)的特異引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT）對樣本的16S rDNA 基因的V3～V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并使用Illumina MiSeq 平臺進(jìn)行雙端測序。過濾低質(zhì)量序列后，對雙端測序序列進(jìn)行拼接，利用VSEARCH（2.17.0）去除嵌合體并聚類生成操作分類單元（operational taxonomic units，OTU，指將序列歸類操作后獲得分類單元，每個分類單元即OTU），并比對參考數(shù)據(jù)庫SILVA 132（http://www. homd.org/?name=Download&taxonly=1）進(jìn)行物種注釋。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

利用R 4.1.0 和QIIME2 軟件計算α 和β 多樣性指標(biāo)，α 多樣性反映微生物群落的豐度和多樣性，β 多樣性是對不同組間樣本的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析，其中α 多樣性指標(biāo)包括Ace 和Shannon 指數(shù)，分別表征樣本中口腔唾液菌群的物種豐富度和多樣性信息；根據(jù)樣本間的進(jìn)化距離計算Weighted Uni-Frac 距離矩陣，綜合考慮了物種存在與否、豐度及物種之間的進(jìn)化關(guān)系，表征樣本口腔唾液菌群的β 多樣性。采用中位數(shù)與四分位數(shù)范圍［M（P25,P75）］描述非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）描述正態(tài)分布數(shù)據(jù)，構(gòu)成比用［n（%）］描述。一般人口學(xué)特征及α 多樣性組間比較使用t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗，β 多樣性采用Weighted UniFrac 距離進(jìn)行PCoA 主坐標(biāo)分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA，是探究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法），通過圖中樣本中心點之間的距離判斷不同組間菌群的差異，以置換多元方差分析法（Permutational Multivariate Analysis of Variance, PerMANOVA，是分析高緯度數(shù)據(jù)組間差異的方法）分析分組因素對組間差異的解釋度和顯著性。線性判別分析（Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）,是發(fā)現(xiàn)和解釋高緯度數(shù)據(jù)生物標(biāo)識的分析工具，用于評估不同分組間在豐度上有顯著差異的物種，并采用線性回歸分析（LDA）來估算每個物種豐度對差異效果影響的大小。利用LEfSe 平臺（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）分析牙周病組與牙周健康組口腔唾液菌群的組間差異物種，LDA score 預(yù)設(shè)值為2.000。檢驗水準(zhǔn)α=0.050。

2 結(jié)果

2.1 一般人口學(xué)特征和口腔情況比較

本研究共納入了58 名患有牙周病和60 名牙周健康的孕前婦女，牙周病組平均年齡為28 歲，牙周健康組平均年齡為27.5 歲。由表1 可知，除牙周探測深度以外，牙周病組和牙周健康組在年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、受教育程度、口腔保健情況等一般人口學(xué)特征差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。從牙周袋深度來看，相較于牙周健康組，牙周病組婦女的牙周袋普遍較深（P＜0.05）。

表1 牙周病組與牙周健康組孕前婦女一般人口學(xué)特征和口腔情況比較［M（P25,P75）,n(%),±s］Table 1 Comparison of demographic characteristics and oral health conditions of the preconceptional women between the periodontal diseases group and the healthy periodontium group[M(P25,P75),n(%),±s]

表1 牙周病組與牙周健康組孕前婦女一般人口學(xué)特征和口腔情況比較［M（P25,P75）,n(%),±s］Table 1 Comparison of demographic characteristics and oral health conditions of the preconceptional women between the periodontal diseases group and the healthy periodontium group[M(P25,P75),n(%),±s]

注：a 偏態(tài)分布數(shù)據(jù)，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗；b 分類數(shù)據(jù)組間比較采用卡方檢驗；c 正態(tài)分布數(shù)據(jù)，組間比較采用t 檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。d 數(shù)據(jù)存在缺失值，受教育程度、家庭年收入水平及口腔保健情況數(shù)據(jù)缺失個數(shù)依次為4、3、2。

一般特征及口腔情況統(tǒng)計量值P年齡（歲）a BMI（kg/m2）a受教育程度bd專科及以下本科及以上家庭年收入水平bd 10 萬以下10 萬及以上不清楚孕史b牙周健康組（n=60）27.50（25.25,30.00）20.64（19.24,21.83）牙周病組（n=58）28.00（26.00,31.00）20.26（19.41,22.09）0.598-0.145 0.336 0.550 0.884 0.562 14（56.00）44（49.40）11（44.00）45（50.60）0.301 0.860 16（45.70）39（51.30）2（50.00）19（54.30）37（48.70）2（50.00）0.017 0.895否是產(chǎn)史b 40（51.30）20（50.00）38（48.70）20（50.00）0.348 0.555否是52（52.00）8（44.40）48（48.00）10（55.60）口腔保健情況bd 2 年內(nèi)規(guī)律牙檢2 年以上不規(guī)律牙檢從未牙檢牙周袋深度（mm）c 1.705 0.426 30（56.60）15（44.10）13（44.80）1.91±0.25 23（43.40）19（55.90）16（55.20）2.10±0.44-2.973 P＜0.001*

2.2 測序結(jié)果

本次測序共產(chǎn)生1 769 371 條序列，每個樣本的序列數(shù)從11 698 到381 116 不等（平均值為14 994）。經(jīng)過質(zhì)控及均一化處理后，所有序列共生成1 960 個OTU。

2.3 菌群群落特征描述

主成分分析顯示，牙周病組與牙周健康組婦女的口腔唾液微生物組之間存在明顯差異。組間比較來看，兩組唾液中菌群群落構(gòu)成差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.739,P＜0.05），見圖1A。與牙周健康組相比，牙周病組孕前婦女口腔唾液微生物的豐富度顯著更高［646.40（544.57,932.47) vs.777.26（649.64，1 018.83）,Z=2.740,P＜0.05]，提示患有牙周病的孕前婦女口腔內(nèi)富集更多微生物，見圖1B。牙周病組孕前婦女口腔中存在的物種種類多于牙周健康組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義［5.74（5.24,6.11）vs.5.86（5.49,6.24）,Z=1.766,P＞0.05]，見圖1C。

圖1 牙周病組與牙周健康組孕前婦女口腔唾液微生物特征的多樣性比較Fig.1 Comparison of diversity of oral salivary microbiota characteristics of the preconceptional women between the periodontal diseases group and the healthy periodontium group.

2.4 差異物種分析

從LEfSe 的分析結(jié)果可觀察到，牙周病組和牙周健康組孕前婦女的口腔唾液菌群比較，21 個屬或?qū)僖陨戏诸悊卧趦山M間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（LDAscore＞2.000,P＜0.05），線性判別分析得分均高于2，其中與牙周病相關(guān)的類別有12 個，包括FamilyⅪ科、Parvimonas菌屬、Filifactor菌屬等，而在牙周健康組口腔唾液中顯著富集的類別有9 個，如彎曲桿菌科（Campylobacteraceae）、伯杰氏菌屬（Bergeyella）等。從物種進(jìn)化關(guān)系來看，擬桿菌綱（Bacteroidia）家族與牙周病顯著相關(guān)，其分支下的普雷沃菌_7 屬（Prevotella_7）和卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）在患有牙周病的孕前婦女口腔唾液菌群中相對豐度顯著更高；而變形菌綱（Epsilonproteobacteria）、黃桿菌綱（Flavobacteriia）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）這3 個微生物家族與牙周健康呈正相關(guān)，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）分支下的嗜血桿菌屬（Haemophilus）和黃桿菌綱（Flavobacteriia）分支下的彎曲桿菌屬（Campylobacter）在牙周健康組口腔唾液菌群中相對豐度顯著更高，見圖2。

圖2 LEfSe 差異物種分析進(jìn)化分支圖Fig.2 Evolutionary branch diagram by LEfSe different species features analysis

在屬水平上，通過比較與牙周病相關(guān)的6 個屬在牙周病組和牙周健康組口腔唾液菌群中的相對豐度，可觀察到患有牙周病的孕前婦女口腔唾液中致病菌如普雷沃菌_7 屬（Prevotella_7）、卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）及Filifactor菌屬的相對豐度均顯著高于牙周健康組（P＜0.05），見圖3。

圖3 牙周病相關(guān)的差異菌屬在兩組之間的豐度比較圖Fig.3 Comparison of abundance of different microbiota related to periodontal diseases between the two groups

3 討論

口腔微生物組在健康和疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，迄今為止，人類口腔中已發(fā)現(xiàn)了700 多個物種，其中大約32%尚未被培養(yǎng)[12]。而基因組測序和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得對從前未知的微生物進(jìn)行分類學(xué)鑒定成為可能，并能準(zhǔn)確地描述特定微生物組的豐富度和多樣性。

3.1 菌群群落特征比較

本研究采用16S rDNA 高通量基因測序來探索患有牙周病和牙周健康孕前女性的口腔唾液菌群結(jié)構(gòu)的差異。結(jié)果表明，牙周病組與牙周健康組口腔唾液微生物組之間存在明顯差異，牙周病組的唾液樣本中微生物組的豐富度顯著增加，原因可能是牙周病患者的口腔中存在更多的牙周致病菌。多微生物協(xié)同作用和生態(tài)失調(diào)（polymicrobial synergy and dysbiosis hypothesis, PSD）模型認(rèn)為，微生物群落的結(jié)構(gòu)改變（物種組成或單個物種的豐度變化）、致病菌的富集、特定成分或功能基因的變化，都會引起微生物群落的失調(diào)，擾亂宿主體內(nèi)生態(tài)平衡，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。同時這種物理和代謝整合的多微生物群落與失調(diào)的宿主炎癥反應(yīng)之間又能相互作用、相互增強(qiáng)[13]。口腔中菌群豐度增加，菌群負(fù)荷增加，進(jìn)而破壞口腔中微生態(tài)環(huán)境的平衡，導(dǎo)致牙周病癥加重。而炎癥反應(yīng)能通過炎癥滲出液釋放營養(yǎng)物質(zhì)如含血紅素的化合物、氨基酸等推動牙周致病菌的生長，進(jìn)而使口腔中微生物負(fù)荷加重，形成惡性循環(huán)[14]?？谇煌僖阂子诓杉ㄟ^唾液采集檢測，及時發(fā)現(xiàn)口腔微生態(tài)環(huán)境是否發(fā)生變化，這種變化可能引起疾病的發(fā)生、炎癥加重，甚至增加全身性疾病的發(fā)生風(fēng)險，或許將有助于臨床上牙周疾病的預(yù)防、診療，有助于臨床決策。

3.2 差異菌群比較

本研究對牙周病患者和牙周健康者的口腔菌群進(jìn)行差異性研究發(fā)現(xiàn)，從屬水平來看，牙周病患者口腔菌群中多富集嚴(yán)格厭氧菌，如普雷沃菌_7 屬（Prevotella_7）、卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）、Filifactor菌屬和Parvimonas菌屬等，而牙周健康者口腔中顯著富集的多為兼性厭氧或需氧菌如伯杰氏菌屬（Bergeyella）。其中，卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）是公認(rèn)的關(guān)鍵牙周致病菌，極低水平的牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）即可觸發(fā)口腔共生微生物群的數(shù)量和組成結(jié)構(gòu)的變化，引起炎性牙周骨質(zhì)流失，進(jìn)而導(dǎo)致牙周病的發(fā)生[15]。目前研究人員普遍認(rèn)為口腔中P.gingivalis可利用自身的毒力因子如菌毛、牙齦素等黏附并破壞牙周組織，引發(fā)牙周局部炎癥，微生物成分和炎癥介質(zhì)進(jìn)而通過血行播散而到達(dá)母胎界面，從而對不良妊娠結(jié)局的發(fā)生造成一定影響。這種直接途徑—炎癥相關(guān)的方式在低暴露時可引起子宮過度收縮、子宮頸擴(kuò)張和膜完整性喪失，進(jìn)而導(dǎo)致生長受限和早產(chǎn)，高暴露時可能導(dǎo)致自然流產(chǎn)、死產(chǎn)等發(fā)生[16]。還有研究發(fā)現(xiàn)P.gingival可通過不同信號通路誘導(dǎo)絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞（extravillous trophoblast cell,EVT）凋亡，導(dǎo)致子宮螺旋動脈重塑不足，胎盤因血流灌注不足而釋放大量促炎細(xì)胞因子，進(jìn)而引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)先兆子癇[17]。近年來，有不少研究關(guān)注P.gingival在牙周病參與不良妊娠結(jié)局發(fā)生機(jī)制中的角色和作用[18-19]，提示P.gingival誘導(dǎo)EVT凋亡很可能是先兆子癇、低出生體重、早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制。

現(xiàn)有的研究證據(jù)表明了牙周病和先兆子癇、胎膜早破、早產(chǎn)、低出生體重等多種不良妊娠結(jié)局有關(guān)[20-21]，而本研究結(jié)果與之前在普通成人中的研究一致，發(fā)現(xiàn)在患有牙周病的孕前婦女口腔中富集了Parvimonas micra[22]（Parvimonas菌屬下的唯一物種，P.micra）和Filifactor alocis[23]（Filifactor菌屬下的物種之一，F(xiàn).alocis），說明其與牙周病的發(fā)生密切相關(guān)。P.micra是一種新興病原體，常見于口腔和胃腸道，目前越來越多的研究表明P.micra感染與椎間盤炎癥、化膿性關(guān)節(jié)炎和心內(nèi)膜炎等全身系統(tǒng)疾病相關(guān)[24-26]，但目前尚缺乏牙周病患者中P.micra和F.alocis參與不良妊娠結(jié)局發(fā)生機(jī)制的研究，未來仍需要更多的研究以進(jìn)一步闡明。

3.3 本研究的局限性與展望

隨著越來越多的研究證據(jù)表明牙周病與不良妊娠結(jié)局的發(fā)生密切相關(guān)，各國的孕前保健指南中已將口腔檢查納入補(bǔ)充項目之中，但由于對發(fā)生機(jī)制的研究較為缺乏，尚無足夠的證據(jù)支持，我國現(xiàn)有的《孕前和孕期保健指南（2018）》中仍未加入牙周保健的相關(guān)內(nèi)容[27]。目前普遍缺少針對育齡備孕女性牙周病和口腔菌群的研究。本研究的特點在于研究人群是備孕并參加孕前體檢的育齡女性，從中選取牙周病患者和牙周健康的對照組，進(jìn)行差異菌群分析，發(fā)現(xiàn)孕前女性中牙周病患者普遍存在的核心牙周致病菌，為進(jìn)一步闡明牙周病與不良妊娠結(jié)局的關(guān)聯(lián)機(jī)制提供了依據(jù)，亦為將來進(jìn)一步完善孕前和孕期保健策略奠定基礎(chǔ)。本研究的不足之處在于樣本量較小，未能進(jìn)一步分析兩組婦女妊娠結(jié)局的差異，對于此問題將基于隊列資料開展更深入的研究。

3.4 結(jié)論

本研究描述了孕前女性牙周病患者和牙周健康者的口腔菌群特征，并通過差異菌群分析，發(fā)現(xiàn)患有牙周病的孕前婦女口腔中具有更高的微生物豐富度，且富集牙周致病菌，提示育齡女性在備孕前應(yīng)當(dāng)重視牙周健康，保持良好的口腔環(huán)境，必要時應(yīng)及時就診治療牙周疾病。建議為備孕女性提供口腔檢查，為牙周病患者提供及時的治療與保健咨詢服務(wù)。