劉倩宇 李遠(yuǎn)播 董豐收 劉新剛 徐軍 吳小虎 鄭永權(quán) 劉穎超

摘要 為了探究吡蟲啉在植物中的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律，本研究選擇生菜為研究對(duì)象，將其在含有1 mg/kg吡蟲啉的水培液中持續(xù)暴露120 h，利用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)吡蟲啉及其5種代謝物在生菜不同部位動(dòng)態(tài)吸收變化和轉(zhuǎn)運(yùn)分布規(guī)律。結(jié)果表明，吡蟲啉在葉部富集程度明顯高于根部，當(dāng)達(dá)到吸收穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，吡蟲啉在葉部富集程度約為根部的6倍。吡蟲啉在生菜中的吸收和代謝是同步進(jìn)行的，代謝物在生菜葉部的富集程度排序?yàn)椋哼料x啉烯烴>5-羥基吡蟲啉>4，5-二羥基吡蟲啉>6-氯煙酸>吡蟲啉脲，代謝物在葉部富集高于根部。結(jié)果表明吡蟲啉從根部向地上部遷移能力較強(qiáng)，根部施用吡蟲啉可有效防治葉部害蟲。本研究為吡蟲啉的科學(xué)使用，保障農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全提供了必要的數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞 吡蟲啉; 生菜; 吸收; 轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)： X592

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021070

Abstract In order to explore the uptake and translocation of imidacloprid in plants， lettuce was exposed to 1 mg/kg of imidacloprid in hydroponic solution for 120 h. The uptake and translocation of imidacloprid and its five metabolites in lettuce were determined by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The results showed that the accumulation of imidacloprid in leaves was significantly higher than that in roots. When reaching uptake quasi-equilibrium， the accumulation of imidacloprid in leaves was about six times of that in roots. The uptake and metabolism of imidacloprid in lettuce co-occurred， and the concentrations of metabolites in leaves ranked from high to low as followed： imidacloprid-olefin， 5-hydroxy-imidacloprid，4，5-dihydroxy-imidacloprid， 6-chloronicotinic acid， and imidacloprid-urea. The concentration of metabolites in leaves was higher than that in roots. These results suggested that imidacloprid had a better translocation ability from roots to the aboveground， and thus application in roots could effectively prevent and control leaf insect pests. This research provided essential data to support the scientific use of imidacloprid and ensure the quality and safety of agricultural products.

Key words imidacloprid; lettuce; uptake; transformation

吡蟲啉是拜耳公司生產(chǎn)的首個(gè)氯代煙堿殺蟲劑，通過作用于昆蟲的乙酰膽堿受體，擾亂神經(jīng)活動(dòng)達(dá)到殺蟲效果，具有觸殺和胃毒雙重作用[1]。作為全球首個(gè)商品化的新煙堿殺蟲劑，自1991年投放市場(chǎng)以來，已在120多個(gè)國家登記使用[23]。因其具有高水溶性和優(yōu)良的內(nèi)吸傳導(dǎo)性，除噴霧施用外，吡蟲啉也常用于種子及土壤處理[45]。與葉面施藥不同的是，吡蟲啉施用于土壤并被植物吸收，會(huì)代謝成具有殺蟲活性的化合物，且代謝完全取決于植物種類和時(shí)間[67]。因此，研究吡蟲啉在植物體內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律對(duì)其合理使用和農(nóng)產(chǎn)品安全評(píng)價(jià)有著重要意義。

生菜是一種重要的全球內(nèi)廣泛種植的蔬菜，2016年生菜全球總產(chǎn)量超過2 500萬t，其營養(yǎng)價(jià)值較高，不僅味道鮮美，還具有改善腸胃功能、護(hù)肝、降脂等藥用功效[810]。近年來，生菜成為水培蔬菜的主要栽培品種[11]。在其生長(zhǎng)過程中時(shí)常受到蚜蟲的威脅，為保證生菜的產(chǎn)量不可避免地會(huì)使用農(nóng)藥[12]。吡蟲啉可有效抑制蚜蟲的發(fā)生。然而，對(duì)于吡蟲啉研究大多關(guān)注于其環(huán)境毒理和殘留監(jiān)控，對(duì)于其在水培蔬菜中的吸收代謝報(bào)道較少[1315]。為全面了解吡蟲啉對(duì)水培蔬菜的安全風(fēng)險(xiǎn)，本研究探究了吡蟲啉在水培生菜中的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)行為及其代謝物的分析，以期為水培蔬菜上吡蟲啉的合理使用和安全評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試標(biāo)準(zhǔn)品99%吡蟲啉，98.7%吡蟲啉烯烴，99.7%吡蟲啉脲，98% 5-羥基吡蟲啉，98% 4，5-二羥基吡蟲啉，99.2% 6-氯煙酸，購自北京金天然科技發(fā)展有限公司;供試植物為‘羅馬生菜’，種子購自中蔬種業(yè)科技（北京）有限公司;氯化鈉、無水硫酸鎂、甲酸、乙腈，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;N-丙基乙二胺（PSA，40 μm）、石墨化炭黑（GCB，40 μm）、Filter Unit濾膜（0.22 μm），天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

生菜種子以蛭石為基質(zhì)進(jìn)行育苗，待生菜長(zhǎng)出2片真葉后，洗去蛭石，將其移入霍格蘭營養(yǎng)液（四水硝酸鈣945 mg/L，硝酸鉀506 mg/L，硝酸銨80 mg/L，磷酸二氫鉀136 mg/L，硫酸鎂493 mg/L，七水硫酸亞鐵5.56 g/L，乙二胺四乙酸二鈉7.46 g/L，碘化鉀0.83 g/L，硼酸6.2 mg/L，硫酸錳22.3 mg/L，硫酸鋅8.6 mg/L，鉬酸鈉0.25 mg/L，硫酸銅0.025 mg/L，氯化鈷0.025 mg/L）中，待生菜生長(zhǎng)至6葉期，轉(zhuǎn)移到1 L含1 mg/kg吡蟲啉的霍格蘭營養(yǎng)液中進(jìn)行暴露試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)置不含吡蟲啉的對(duì)照組和不含生菜的對(duì)照組。培養(yǎng)條件：光周期L∥D=16 h∥8 h，光照強(qiáng)度250 μmol/（m2·s），溫度為25℃，相對(duì)濕度為60%，pH為6.5。分別在暴露后2、6、12、24、48、72、96 h和120 h后采集樣品，各3個(gè)重復(fù)。用蒸餾水沖洗根部表面的吡蟲啉殘留，用濾紙吸干后，將每個(gè)植株分割為根部和葉部，放置于-20℃冰箱保存，待測(cè)。

1.3 測(cè)定方法

提?。簻?zhǔn)確稱取生菜根或葉均質(zhì)樣品1.00 g，并量取水培液樣品1 mL，置于10 mL聚四氟乙烯離心管中，加入2 mL質(zhì)量濃度1%的甲酸乙腈，以2 500 r/min渦旋提取10 min。然后加入1.0 g NaCl，以2 500 r/min渦旋5 min，最后以4 000 r/min離心5 min，待凈化。水培液樣品上清液直接過0.22 μm有機(jī)濾膜，無需凈化。

凈化：對(duì)于根部樣品，移取1.2 mL離心后的上清液（乙腈層）至裝有50 mg PSA+150 mg無水硫酸鎂的2 mL離心管中;對(duì)于葉部樣品，移取1.2 mL離心后的上清液（乙腈層）至裝有50 mg PSA+10 mg GCB+150 mg無水硫酸鎂的2 mL離心管中，2 500 r/min 渦旋1 min，再以5 000 r/min 離心5 min后，將凈化過的上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，待UPLC-MS/MS檢測(cè)。

檢測(cè)：采用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀ACQUITY UPLC-TQS（Waters公司）進(jìn)行樣品檢測(cè)，采用電噴霧離子源，正離子電離模式（ESI+），其中離子源溫度150℃，毛細(xì)管電壓3.5 kV，去溶劑溫度500℃，去溶劑氣（N2）流量650 L/h，錐孔反吹氣（N2）流量50 L/h。采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），具體參數(shù)見表1。色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）;柱溫：30℃;流動(dòng)相：0.2%甲酸水溶液、乙腈：流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量：5 μL;梯度洗脫條件見表2。

1.4 數(shù)據(jù)分析

吡蟲啉在生菜中的吸收速率：

式中，k為單位時(shí)間的吸收速率常數(shù)[μg/（kg·h）]，ta和tb為時(shí)刻a和b，Ca、Cb分別表示吡蟲啉在a和b時(shí)刻在生菜中的累積量。

吡蟲啉在生菜中的富集程度，用根部富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)來表示：

式中，RCF為根部富集系數(shù)（root concentration factor，RCF），TF為轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（translocation factor，TF），Cwater為吡蟲啉在水培液中的含量（μg/L），Croot為吡蟲啉在根部的含量（μg/kg）。Cleaf為吡蟲啉在葉部的含量（μg/kg）。

數(shù)據(jù)采用Excel 2019處理，并用Origin 2017作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立吡蟲啉及其代謝物UPLC-MS/MS檢測(cè)方法

采用1.3的檢測(cè)方法，濃度在0.005～1 mg/L范圍內(nèi)吡蟲啉及其代謝物的峰面積與其濃度均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)R2均大于0.99。在水培液中添加0.005，0.05 mg/L和5 mg/L吡蟲啉及其代謝物，在生菜根和葉中分別添加0.005，0.05 mg/kg和5 mg/kg吡蟲啉及其代謝物，其添加回收率均在85.51%～103.01%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.13%～18.31%。符合農(nóng)藥殘留分析條件。吡蟲啉及其代謝物在各基質(zhì)中的定量限（limit of quantitation，LOQ）為0.005 mg/kg。

2.2 生菜不同部位吡蟲啉的吸收和累積動(dòng)態(tài)

生菜對(duì)吡蟲啉的吸收動(dòng)態(tài)如圖1所示。初始暴露2 h時(shí)，吡蟲啉在根部累積量為（471.16±19.14） μg/kg，6～12 h，吡蟲啉在根部的吸收速率k達(dá)到最大，為19.88 μg/（kg·h），隨后吸收速率逐漸降低。在2～120 h內(nèi)，吡蟲啉在根部累積量為142.87～516.15 μg/kg，在120 h的累積量達(dá)到最大。在葉部，吡蟲啉的富集程度隨暴露時(shí)間增加逐漸升高，在120 h的累積量達(dá)到最大，為（3 098.75±114.82） μg/kg。在72～96 h吡蟲啉在生菜葉部的吸收速率最大，為73.13 μg/（kg·h）， 是根部最大吸收速率的3.68倍。在120 h吡蟲啉在葉部殘留累積量為根部的6倍。

2.3 吡蟲啉在生菜中的富集和轉(zhuǎn)運(yùn)

吡蟲啉在生菜不同部位的富集和轉(zhuǎn)運(yùn)能力由根部富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)來表征。如表3所示，吡蟲啉的根部富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)隨暴露時(shí)間的增加整體表現(xiàn)為逐漸增高。然而，在暴露時(shí)間少于120 h時(shí)根部富集系數(shù)均小于1。0～120 h根部富集系數(shù)在0.23～1.00之間;轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)范圍為0.06～6.83，在暴露時(shí)間少于24 h時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均小于1，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)大于2。吡蟲啉在生菜中吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)在暴露96 h時(shí)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，平衡后的RCF≈1，TF>6。

2.4 吡蟲啉5種代謝物的動(dòng)態(tài)變化

吡蟲啉在生菜中的代謝途徑如圖2所示。5種代謝物在生菜中隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化如圖3所示。吡蟲啉脲在根部未檢出但在葉部有檢出。在根部檢測(cè)到的4個(gè)代謝物的累積量表現(xiàn)為先降低后升高最后趨于穩(wěn)定的特征。在葉部，代謝物吡蟲啉烯烴、5-羥基吡蟲啉、4，5-二羥基吡蟲啉和6-氯煙酸的累積量均隨時(shí)間增加逐漸升高，而吡蟲啉脲則是呈現(xiàn)先升高，隨后逐漸降低并趨于穩(wěn)定。吸收達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)（96～120 h），相對(duì)于其他代謝產(chǎn)物，吡蟲啉烯烴在根部和葉部富集程度均為最大。在生菜根部，4種代謝物吡蟲啉烯烴、4，5-二羥基吡蟲啉、6-氯煙酸和5-羥基吡蟲啉累積量分別是10.77～12.73、7.44～10.50、5.71～6.14 μg/kg和4.32～6.81 μg/kg。在葉部5種代謝物吡蟲啉烯烴、4，5-二羥基吡蟲啉、6-氯煙酸、5-羥基吡蟲啉和吡蟲啉脲累積量分別為11.75～29.66、13.64～17.42、7.28～14.82、8.47～23.43 μg/kg和7.67～11.01 μg/kg。

3 討論

本研究建立了吡蟲啉及其5種主要代謝物在生菜根、葉和水培營養(yǎng)液中的殘留分析方法，LOQ均為0.005 mg/kg，相對(duì)于董見南等[16]建立的3種蕓薹屬蔬菜中吡蟲啉殘留分析方法（LOQ為0.02 mg/kg），靈敏度更高。梁秀美等[17]基于QuEChERS方法對(duì)茶花花粉中的吡蟲啉及其3種代謝物吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲和6-氯煙酸進(jìn)行了2次提取。本研究提取方法僅為1次提取，方法簡(jiǎn)單，且監(jiān)測(cè)的代謝物更多。

吡蟲啉在生菜各部位中的富集程度隨著暴露時(shí)間的增加而升高，在暴露120 h時(shí)，吡蟲啉在根部和莖葉部的累積量均達(dá)到最大，且在葉部的吸收速率和累積量均大于根部。在水培生菜體系中，吡蟲啉在葉部的累積量約是根部的6倍。吸收穩(wěn)定時(shí)，吡蟲啉的RCF≈1，而TF>6，說明吡蟲啉極易向地上部遷移。農(nóng)藥的根部吸收被認(rèn)為是一個(gè)被動(dòng)過程，吡蟲啉具有較強(qiáng)的水溶性，其logKow為0.57，在根部可在極短時(shí)間內(nèi)達(dá)到吸收穩(wěn)態(tài)[18]。木質(zhì)部是農(nóng)藥遷移和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要組織，蒸騰拉力是水分等在木質(zhì)部運(yùn)輸?shù)闹饕獎(jiǎng)恿Γ捎谶料x啉較高的水溶性，很容易隨蒸騰作用進(jìn)入木質(zhì)部進(jìn)而向葉部轉(zhuǎn)運(yùn)[19]。

在本研究中，吡蟲啉代謝物在水培生菜葉部富集程度排序?yàn)椋哼料x啉烯烴>5-羥基吡蟲啉>4，5-二羥基吡蟲啉>6-氯煙酸>吡蟲啉脲。Wu等[20]指出灌根條件下，吡蟲啉烯烴在棉花根、莖、葉、花蕾和棉鈴上的累積量遠(yuǎn)高于吡蟲啉脲和6-氯煙酸。Juraske等[21]指出相對(duì)于莖葉噴霧，根部施藥其在植物中的分布更均勻。吡蟲啉根部施用比莖葉噴霧對(duì)蚜蟲和粉虱防治效果更好[2223]。根部施用的吡蟲啉被植物吸收后，可以在植株體內(nèi)轉(zhuǎn)化為比母體毒性更高的代謝物[2425]。Dai等[26]提出吡蟲啉烯烴具有比母體更高的殺蟲活性。Nauen等[24]發(fā)現(xiàn)吡蟲啉烯烴對(duì)棉蚜的胃毒毒性是吡蟲啉母體的16倍。本研究結(jié)果表明，5種代謝物中，吡蟲啉烯烴在生菜葉部的富集程度最高，該結(jié)果為吡蟲啉生菜害蟲的防治提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在水培條件下探究了吡蟲啉在生菜中的吸收遷移與轉(zhuǎn)化行為，結(jié)果表明吡蟲啉吸收和代謝兩個(gè)過程是同時(shí)發(fā)生的。吡蟲啉具有較強(qiáng)的地上遷移能力，通過根部施用可有效防治葉部害蟲。吡蟲啉對(duì)蚜蟲的藥效作用可能是吡蟲啉及其高毒代謝物特別是吡蟲啉烯烴共同作用的結(jié)果。吡蟲啉的田間施用可采用低劑量包衣方式，既可以減少農(nóng)藥的使用量，還可以高效防治葉部害蟲。本研究為吡蟲啉的科學(xué)使用，保障農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全提供了科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）