楊陽，王升儒，朱乾坤，郭建偉，林莞鋒，仉建國

先天性脊柱側(cè)凸（congenital scoliosis,CS）是最常見的脊柱畸形類型之一[1]，是指由于脊椎結(jié)構(gòu)異常引發(fā)脊柱生長不平衡進(jìn)而導(dǎo)致的脊柱側(cè)凸[2]。文獻(xiàn)報道CS的總患病率為活產(chǎn)嬰兒的（0.5～1）/1000[3]。研究表明脊柱發(fā)育過程中的基因突變[4]或妊娠期的有害環(huán)境因素[5]均可導(dǎo)致CS的發(fā)生。目前CS的確切發(fā)病機(jī)制仍不清楚，也缺乏公認(rèn)的早期診斷生物標(biāo)志物。

microRNAs（miRNAs）是一系列長度為19～25 個核苷酸的短鏈非編碼RNA[6]。miRNAs 由RNA 酶Dicer切割的較大前體產(chǎn)生，是mRNA的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子[7]。通過與目標(biāo)mRNA的3＇非翻譯區(qū)（3＇UTR）結(jié)合，miRNAs可以促進(jìn)mRNA的降解和/或抑制蛋白質(zhì)翻譯，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。據(jù)估計(jì)，miRNAs的潛在生物學(xué)作用與轉(zhuǎn)錄因子的5＇調(diào)控區(qū)的作用相當(dāng)[8,9]。大量證據(jù)表明，miRNAs可以調(diào)節(jié)廣泛的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡和血液生成[10]。miRNAs的表達(dá)也與很多疾病的發(fā)生有關(guān)。研究表明miRNAs 與骨密度[11]、椎間盤退變[12]和特發(fā)性脊柱側(cè)凸[13]等密切相關(guān)。此外，miRNAs還參與了成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和其他間充質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)[14-16]。因此，miRNAs很可能參與了CS的發(fā)病機(jī)制。目前關(guān)于CS患者中的差異表達(dá)miRNAs仍不明確，其表達(dá)譜仍然未知。本課題組認(rèn)為，與健康人相比，CS患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中存在差異表達(dá)的miRNAs，這些差異miRNAs可能為進(jìn)一步探索CS的發(fā)病機(jī)制和生物標(biāo)志物提供新的線索。本研究的主要目標(biāo)是鑒定CS患者與健康人之間差異表達(dá)的miRNAs，并對差異miRNAs進(jìn)行深入的生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究為單中心的病例-對照研究。

CS患者的納入標(biāo)準(zhǔn)為：有CS的臨床表現(xiàn)，且脊柱X線片顯示脊柱側(cè)凸超過10°；排除標(biāo)準(zhǔn)為：特發(fā)性脊柱側(cè)凸、神經(jīng)肌肉性脊柱側(cè)凸或已知的綜合征（如Alagille 綜合征、Goldenhar 綜合征、Klippel-Feil 綜合征、脊椎軟骨發(fā)育不良、脊椎胸廓發(fā)育不良等）。CS患者分為形成障礙和分節(jié)障礙兩個亞組。

健康對照組受試者的種族、性別和年齡與CS組患者相匹配。其納入標(biāo)準(zhǔn)為：無先天性畸形、神經(jīng)肌肉疾病、骨骼發(fā)育不良、結(jié)締組織異常和神經(jīng)系統(tǒng)等疾病。

本研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會審批（批準(zhǔn)號：JS-098），受試者（≥18 歲）或其父母（＜18 歲的受試者）均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

經(jīng)髂后上棘穿刺抽取約10 ml 骨髓，然后通過Ficoll 梯度離心分離單核細(xì)胞，在37°C、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)基成分包括Dulbecco 改良的Eagle 培養(yǎng)基（DMEM，美國Sigma-Aldrich 公司）、10 mmol/L Hepes（美國Sigma-Aldrich公司）、100 U/ml 青霉素/鏈霉素（P/s，美國Gibco 公司）和10%胎牛血清（美國Gibco公司）。經(jīng)過CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73 和CD105 抗體孵育后，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型標(biāo)記物的表達(dá)（美國BD Bioscience 公司）。通過茜素紅染色和油紅-O染色分別評估間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和成脂分化能力。

1.3 總RNA提取

使用TRIzol（美國Invitrogen 公司）提取總RNA，并使用miRNeasy 試劑盒（美國QIAGEN 公司）純化。采用分光光度法檢測RNA 純度，光密度（optical density,OD）中OD260/OD280為0～2和OD260/OD230＞1.8視為符合標(biāo)準(zhǔn)。凝膠電泳確定RNA完整性，28S/18S＞2被認(rèn)為符合標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 miRNAs標(biāo)記

從樣本中分離RNA后，使用miRCURYTM Hy3TM/Hy5TMPower labeling kit（丹麥，Exiqon 公司）標(biāo)記miRNAs。3 μl H2O體積中，取3 μg RNA與0.5 μl CIP緩沖液和0.5 μl CIP酶混合。使用PCR循環(huán)器將混合物在37°C下培養(yǎng)30 min。在95℃下終止反應(yīng)5 min。然后，添加3 μl標(biāo)記緩沖液、1.5 μl熒光標(biāo)記、2 μl二甲基亞砜和2 μl標(biāo)記酶，啟動標(biāo)記反應(yīng)。16°C反應(yīng)60 min，65°C孵化15 min后終止。

1.5 miRNAs陣列雜交和掃描

利用Hy3TM標(biāo)記反應(yīng)進(jìn)行陣列雜交。25 μl標(biāo)記的樣品與90 μl 2×雜交緩沖液和65 μl去核酸酶緩沖液混合，95°C下避光孵育2 min，然后冰上孵育2 min。將雜交試劑在56°C 下進(jìn)行反應(yīng)持續(xù)16～20 h。之后在56°C 下，在緩沖液A 中反應(yīng)并洗滌2 min，進(jìn)一步在室溫條件下在緩沖液B中清洗2 min。以200×g離心干燥載玻片5 min。使用Axon GenePix 4000B 微陣列掃描儀（美國Axon Instruments 公司）和GenePix pro V6進(jìn)行掃描，提取圖像原始密度。

1.6 miRNAs分析

通過前景減去背景來計(jì)算信號強(qiáng)度。取同一載玻片的每個探針上的4 個重復(fù)點(diǎn)的平均值。在計(jì)算歸一化時，只計(jì)算強(qiáng)度＞30的樣本，即（前景-背景）/中值。使用R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法包括未配對的Studentt檢驗(yàn)（假設(shè)方差和正態(tài)分布相等）、WelchT檢驗(yàn)（假設(shè)正態(tài)分布但方差不相等）或Wilcoxon檢驗(yàn)（假設(shè)偏態(tài)分布或方差不相等）。確定差異表達(dá)miRNAs 的標(biāo)準(zhǔn)為：倍數(shù)變化≥2 或≤0.5，且P＜0.05。倍數(shù)變化為CS 患者組標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度的平均值除以健康對照組的平均值。

1.7 生物信息學(xué)分析

使用Blast2GO 軟件對差異表達(dá)的miRNAs 進(jìn)行基因本體注釋。繪制火山圖顯示總體miRNAs 和差異表達(dá)的miRNAs。對各組間差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行層次聚類分析（hierarchical clustering analysis,HCA），并構(gòu)建樹狀圖。應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫富集與差異表達(dá)miRNAs的靶基因相關(guān)的通路。

1.8 qRT-PCT驗(yàn)證

根據(jù)表達(dá)譜和和生物學(xué)功能的分析結(jié)果，本課題組從差異表達(dá)的miRNAs 列表中挑選出7 個miRNAs，使用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。使用2-ΔΔCT方法分析基因表達(dá)。U6 RNA為內(nèi)部對照。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者的一般臨床資料

如表1所示，本研究共納入了3例形成障礙的CS患者（形成障礙亞組，均為單一半椎體畸形）和3例分節(jié)障礙的CS患者（分節(jié)障礙亞組，均為胸段脊柱分節(jié)障礙）。健康對照組納入了5 名年齡、性別匹配的受試者。兩組CS患者年齡與健康對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.401、0.829）。所有受試者均為中國北方漢族。

表1 入組受試者的一般情況

2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定

光鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞均呈梭形。免疫表型鑒定表明，培養(yǎng)細(xì)胞的CD31、CD34 和CD45 表達(dá)呈陰性，CD29、CD44、CD73 和CD105 表達(dá)呈陽性。茜素紅染色和油紅-O染色證實(shí)了細(xì)胞的成骨和成脂分化能力，說明本實(shí)驗(yàn)分離的細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞。

2.3 CS組與健康對照組之間miRNAs的差異表達(dá)

在差異表達(dá)的候選miRNAs 鑒定過程中，差異miRNAs需要同時滿足2個標(biāo)準(zhǔn)（倍數(shù)變化≥2或≤0.5，且P＜0.05）。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，在形成障礙亞組與健康對照組之間共有29 個差異miRNAs，包括14 個表達(dá)上調(diào)的miRNAs 和15 個表達(dá)下調(diào)的miRNAs。在分節(jié)障礙亞組與健康對照組之間共有27個差異miRNAs，包括6 個表達(dá)上調(diào)的miRNAs 和21 個表達(dá)下調(diào)的miRNAs。在這兩組顯著差異表達(dá)的miRNAs之間有10個為共同出現(xiàn)的miRNAs（圖1，表2）。

表2 形成障礙亞組、分節(jié)障礙亞組與對照組之間差異表達(dá)的miRNAs

圖1 各組間總miRNAs和差異表達(dá)miRNAs的火山圖

2.4 共同差異表達(dá)miRNAs的GO富集分析

為了從功能上注釋差異表達(dá)的miRNAs，本研究使用Blast2GO 軟件對10 個共同差異表達(dá)的miRNAs 進(jìn)行了GO 富集分析。在生物過程富集中，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（P=3.53E-5）、small GTPase 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（P=8.26E-5）和通過死亡域受體對外源性凋亡信號通路的正調(diào)控（P=8.73E-5）是最顯著的富集項(xiàng)。在細(xì)胞成分中，高爾基體部分（P=1.01E-4）、高爾基膜（P=1.97E-4）和細(xì)胞器結(jié)合膜（P=4.26E-4）是前3個顯著富集的條目。同樣，蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶激活劑活性（P=2.70E-4）、酶結(jié)合（P=7.16E-4）和GTPase 活性（P=1.06E-3）是最顯著富集的分子功能類別（圖2）。

圖2 使用Blast2GO進(jìn)行GO富集分析

2.5 HCA

本研究進(jìn)一步進(jìn)行了HCA，以確定各樣本間的miRNAs表達(dá)譜。結(jié)果顯示健康對照組與CS兩亞組之間存在明顯的差異表達(dá)miRNAs（圖3A、圖3B）。將CS兩亞組差異表達(dá)miRNAs的合集與健康對照組進(jìn)行HCA，結(jié)果顯示無異常分類，所有患者的分列狀況和疾病狀態(tài)基本一致（圖3C）。此外，對10個共同差異表達(dá)的miRNAs 進(jìn)行分析顯示，健康對照組和CS組之間可見明顯表達(dá)差異（圖3D）。

圖3 各組間miRNAs表達(dá)的HCA

2.6 KEGG信號通路分析

使用KEGG通路數(shù)據(jù)庫尋找與10個共同差異表達(dá)miRNAs相關(guān)的基因，共涉及12條重要通路（P＜0.05）。其中，最重要的信號通路涉及黏蛋白型O-聚糖的生物合成（圖4）。其次是Fc-γR 介導(dǎo)的吞噬作用、青少年的成熟型糖尿病、癌癥相關(guān)信號通路、Wnt 信號通路、凋亡、小泡運(yùn)輸中的SNARE相互作用、甲狀腺激素信號途徑、突觸小泡周期、Hippo信號途徑、HTLV-I感染和NF-κB信號通路。

圖4 共同差異表達(dá)的10個miRNAs的靶向基因中最顯著的KEGG途徑

2.7 qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證miRNAs微陣列芯片的分析結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)中報道的miRNAs 的相關(guān)功能，本研究選擇了7個miRNAs進(jìn)行qRT-PCR分析。與健康對照組相比，CS 組2 個miRNAs（miR-412-3p 和miR-766-5p）的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），3個miRNAs的表達(dá)趨勢與微陣列芯片分析結(jié)果一致，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。另外2 個miRNAs 的表達(dá)與微陣列芯片分析的表達(dá)趨勢不一致（圖5）。

圖5 CS組與健康對照組之間差異表達(dá)miRNAs的qRT-PCR驗(yàn)證

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)中，為了深入探索CS 的發(fā)病機(jī)制并尋找潛在的候選生物標(biāo)志物，本課題組在CS患者和健康人的間充質(zhì)干細(xì)胞中進(jìn)行了miRNAs 表達(dá)的相關(guān)分析。CS 可分為形成障礙型、分節(jié)障礙型、混合型，其中混合型患者同時存在椎體的形成障礙和分節(jié)障礙。本研究納入了2 個亞型的CS 患者：形成障礙型亞組及分節(jié)障礙型亞組。雖然二者都屬于CS，但其臨床表現(xiàn)仍有不同，因此本課題組認(rèn)為這兩亞組CS患者之間miRNAs 的表達(dá)也應(yīng)該存在一定的差異。因此，在分別與健康對照組進(jìn)行對比得到兩亞組CS患者差異表達(dá)miRNAs（29 個miRNAsvs27 個miRNAs）后，對這兩亞組CS 患者差異表達(dá)的miRNAs 取交集，得到在兩亞組CS 患者中都存在差異表達(dá)的10 個miRNAs。這10 個共同差異表達(dá)的miRNAs 可代表CS 患者與健康人之間的差異，這對于分析CS的發(fā)病機(jī)制可能更有價值。

本研究的GO分析結(jié)果與CS既往報道發(fā)病機(jī)制的某些方面相一致。例如，生物過程富集的結(jié)果表明某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對CS的發(fā)病有潛在影響。有文獻(xiàn)報道提示Notch、FGF 和Wnt 等信號通路的異常會導(dǎo)致胚胎期的體細(xì)胞發(fā)育障礙，從而導(dǎo)致脊柱畸形[17-20]。因此，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是CS 發(fā)病中的重要生物過程。此外，在Notch 信號通路中，在高爾基體中表達(dá)的delta 樣配體（DLL）3[21]與Notch 共表達(dá)時，被證明是配體誘導(dǎo)的Notch信號的有效拮抗劑[22]。DLL3還可促進(jìn)胚胎的初級神經(jīng)發(fā)生，并可在體外增強(qiáng)神經(jīng)祖細(xì)胞的神經(jīng)元分化[22]。從這個意義上講，DLL3 在發(fā)育過程中具有重要作用，高爾基體也可能是一個新的干預(yù)靶點(diǎn)。在GO的其他兩個分析中，蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶激活劑活性的分子功能也與之前的報道一致[23]。Ⅰ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體ActRIA 的純合突變會嚴(yán)重破壞小鼠胚胎中胚層的形成[23]，這表明絲氨酸/蘇氨酸激酶可能在CS中發(fā)揮作用。因此，絲氨酸/蘇氨酸激酶激活劑活性相關(guān)的miRNA 在胚胎水平的表達(dá)值得進(jìn)一步研究。

層次聚類是一種簡單的算法，通過一個迭代過程來檢測物體的基本距離，該迭代過程將一個對象合并（聚合方法）或分割（分裂方法），直到所有對象處理完畢[24]。本研究采用歐幾里德方法進(jìn)行聚類分析，該方法可以克服由極值產(chǎn)生的偏差[25]。結(jié)果顯示CS組和健康對照組形成兩個不同的集群，這表明CS患者彼此之間的數(shù)學(xué)距離較小，因此在較低的點(diǎn)合并，表明CS 患者具有獨(dú)特的miRNAs 表達(dá)譜。通過層次聚類得到的結(jié)果可有助于構(gòu)建診斷甚至預(yù)測疾病的生物標(biāo)志物。

KEGG 數(shù)據(jù)庫旨在通過計(jì)算已知的生物過程和標(biāo)準(zhǔn)化基因注釋，將高通量基因信息與高級功能進(jìn)行富集分析[26]。本研究通過對標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫的整理，發(fā)現(xiàn)黏蛋白型O-聚糖的生物合成是最顯著的信號通路。黏蛋白型糖蛋白是一類由碳水化合物側(cè)鏈修飾的聚糖，稱為O-聚糖，可修飾蛋白質(zhì)的絲氨酸（Ser）或蘇氨酸（Thr）殘基[27]。合成O-聚糖的第一步是添加UDP-N-乙酰半乳糖胺（GalNAc），蛋白質(zhì)主鏈的Ser/Thr殘基轉(zhuǎn)化為Tn抗原（GalNAc-α-1-O-Ser/Thr）[28]。這一過程由一個名為UDP-GalNAc的多基因酶家族催化：多肽α-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶（ppGalNAcTs）。隨后，根據(jù)添加的糖的不同，Tn結(jié)構(gòu)的延伸可導(dǎo)致8種不同的O-聚糖核心結(jié)構(gòu)：核心1～8[29]。大量研究表明，黏蛋白型O-聚糖在動物發(fā)育中非常重要。在果蠅中，ppGalNAcTs 酶亞型pgant35A突變是隱性致死 的[30]，其潛在異?？蓪?dǎo)致呼吸系統(tǒng)中氣管形成異常，特征是頂端和管腔O-聚糖和頂端蛋白Crbs減少[31]。與果蠅不同，迄今為止，在哺乳動物發(fā)育過程中尚未發(fā)現(xiàn)致命的黏蛋白型O-糖基化先天性疾病，這可能是因?yàn)镺-聚糖不是哺乳動物發(fā)育所必需的，或者存在許多功能的代償機(jī)制[32]。既往文獻(xiàn)報道了黏蛋白型O-聚糖合成缺陷導(dǎo)致的幾種非致命性先天性疾病。Tn綜合征的臨床特征為溶血或血小板減少，是由T-合酶伴侶Cosmc 對糖基轉(zhuǎn)移酶酶活性的異常作用引起的[33]。IgA腎病與C1GalT1基因變異導(dǎo)致的O-聚糖的半乳糖苷化有關(guān)[34]。高磷血癥家族性腫瘤性鈣質(zhì)沉著癥可由編碼ppGalNAc-T3的基因Galnt3[35]突變引起。此外，卵巢癌和急性冠狀動脈綜合征分別與Galnt1[36]和Galnt4[37,38]有關(guān)。結(jié)腸癌和結(jié)腸炎等腸道疾病與黏蛋白型O-聚糖合成失調(diào)有關(guān)[39,40]。目前尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報道黏蛋白型O-聚糖與CS直接相關(guān)。在骨骼研究領(lǐng)域，有一篇文獻(xiàn)報道了黏蛋白型O-聚糖與骨骼疾病的關(guān)聯(lián)：軟骨細(xì)胞中Galnt3的過度表達(dá)可通過黏蛋白型O-聚糖的增加導(dǎo)致侏儒癥[41]。侏儒癥的部分表型與某些CS患者的表型重疊，由此推測黏蛋白型O-聚糖的合成可能部分參與CS的發(fā)病，但其確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了CS 患者與健康人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的差異miRNAs 表達(dá)譜。這些miRNAs可能對CS的病因具有重要意義，并有助于探索相關(guān)診斷標(biāo)志物，但后續(xù)仍需深入研究來闡明其潛在的機(jī)制。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突