閆曉紅，王偉，袁玥，趙亞寧

（寶雞市中心醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，陜西 寶雞721008）

肺癌占我國城市居民惡性腫瘤致死疾病的首位，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）較為常見，在所有肺癌患者中占比約為80%[1]。調(diào)查顯示[2]，NSCLC 患者確診時多處于中晚期，5年生存率低至50%，即使手術(shù)切除，術(shù)后1年復發(fā)率仍可高達20%～60%，5年生存率僅約為60%。研究NSCLC 患者術(shù)后復發(fā)的影響因素十分必要。細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、p27 蛋白均是細胞生長周期的調(diào)控因子。CyclinD1 定位于染色體11q13，在細胞周期G1 向S 期轉(zhuǎn)化過程中起關(guān)鍵作用，可增強癌細胞的增殖活性，在NSCLC、宮頸癌等多種惡性腫瘤組織中高表達[3-4]。p27 定位于染色體9p21，是細胞周期調(diào)控的關(guān)鍵因子，能夠抑制細胞周期蛋白依賴性激酶復合物的活性，其表達水平越低，細胞的增殖活性越強，在NSCLC、胃癌等惡性腫瘤組織中低表達[5-6]。研究[7]提示NSCLC 患者癌組織中CyclinD1 蛋白陽性表達率高，p27 蛋白陽性表達率低。本研究回顧性分析125 例NSCLC 患者的臨床資料，探討CyclinD1 蛋白和p27 蛋白與NSCLC 患者臨床病理學特征、術(shù)后復發(fā)的關(guān)系，旨在為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2016年5月—2018年3月寶雞市中心醫(yī)院就診的125 例NSCLC 患者的臨床資料。納入標準：①經(jīng)手術(shù)切除且術(shù)后病理確診為NSCLC；②術(shù)后接受跟蹤隨訪，隨訪時間≥1年（病情進展死亡除外）；③有完整的病歷資料。排除標準：①復發(fā)性或轉(zhuǎn)移性NSCLC；②隨訪期間非NSCLC 原因死亡；③臟器功能不全、精神異常或認知障礙；④本人或家屬拒絕調(diào)閱、回顧其臨床資料。125 例NSCLC 患者中，男性82 例，女性43 例；年齡41～77 歲，平均（61.52±7.89）歲，≥60 歲68 例，＜60 歲57 例；腫瘤直徑3.2～11.5 cm，平均（6.85±1.02）cm，最大腫瘤直徑＞5 cm 者73 例；臨床分期Ⅰ期7 例，Ⅱ期52 例，Ⅲa 期66 例；分化程度低分化34 例，中分化59 例，高分化32 例；病理類型鱗癌74 例，腺癌41 例，大細胞癌10 例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學SP 法檢測CyclinD1、p27 蛋白表達 鼠抗人CyclinD1、p27 單克隆抗體、兔抗鼠CyclinD1、p27 多克隆抗體購自英國Abcam 公司，免疫組織選項SP 試劑盒購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。取研究對象的癌組織和癌旁組織（距離癌組織≥2 cm）石蠟標本切片，厚度4 μm。取鼠抗人CyclinD1、p27 單克隆抗體、兔抗鼠CyclinD1、p27 多克隆抗體（以辣根過氧化酶標記）依次處理切片。所有組織切片采用微波修復受損的抗原，按照免疫組織化學SP 試劑盒說明書操作，添加二氨基聯(lián)苯胺溶液顯色，蘇木精復染。陰性對照為磷酸鹽緩沖液代替一抗的標本，陽性對照為已知的陽性片。由病理科2 位副主任醫(yī)師在光學顯微鏡下觀察染色強度和范圍，隨機選取10 個不重復高倍鏡視野，采用盲法評價蛋白表達情況。染色強度評分：未著色0 分，淡黃或淺黃色1 分，黃色2 分，棕褐色3 分。陽性細胞百分比評分：染色細胞占視野細胞的1%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%為4 分。計算2 項得分的總和，結(jié)果為0～1 記為蛋白陰性表達，否則記為蛋白陽性表達[8]。若2 位副主任醫(yī)師評價結(jié)果一致，則如實記錄；若評價結(jié)果不一致，則交由本院第三方（臨床研究中心）裁定。

1.2.2 隨訪 患者隨訪時間為1～3.5年。所有患者均于術(shù)后1 個月、3 個月、6 個月、9 個月、12 個月定期到院復查，不適隨診，利用影像學檢查觀察是否有殘端病變，并結(jié)合病理學檢查確診，若發(fā)現(xiàn)腫瘤切除殘端有NSCLC 病變者記為復發(fā)，計算復發(fā)率。歸納可能影響NSCLC 患者術(shù)后復發(fā)的因素，包括性別、年齡、臨床分期、分化程度、病理類型、術(shù)式、淋巴結(jié)清掃、術(shù)后放化療、癌組織CyclinD1 蛋白表達、癌組織p27 蛋白表達等。

1.3 觀察指標

①癌組織、癌旁組織CyclinD1、p27 蛋白陽性表達率；②不同臨床病理特征患者癌組織CyclinD1、p27 蛋白陽性表達率；③復發(fā)和未復發(fā)患者癌組織CyclinD1、p27 蛋白陽性表達率；④癌組織CyclinD1、p27 蛋白表達與NSCLC 患者術(shù)后復發(fā)的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗，影響因素的分析采用Cox 逐步回歸模型。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織和癌旁組織CyclinD1、p27蛋白陽性表達率比較

癌組織和癌旁組織CyclinD1、p27 蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），癌組織CyclinD1 蛋白陽性表達率高于癌旁組織，p27 蛋白陽性表達率低于癌旁組織（見表1）。CyclinD1、p27蛋白主要表達于細胞核，癌組織和癌旁組織中CyclinD1、p27 蛋白表達見圖1。

圖1 癌組織和癌旁組織CyclinD1、p27蛋白的表達 （免疫組織化學×400）

表1 癌組織和癌旁組織CyclinD1、p27蛋白陽性表達率比較 [n=125，例（%）]

2.2 不同臨床病理特征患者癌組織CyclinD1、p27蛋白陽性表達率比較

不同性別、年齡、最大腫瘤直徑、病理類型患者癌組織CyclinD1 蛋白陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同臨床分期、分化程度患者癌組織CyclinD1 蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Ⅲa 期患者癌組織CyclinD1 蛋白陽性表達率高于Ⅰ、Ⅱ期，低分化患者癌組織CyclinD1 蛋白陽性表達率高于中高分化患者。不同性別、年齡、最大腫瘤直徑、病理類型患者癌組織p27 蛋白陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同臨床分期、分化程度患者癌組織p27 蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Ⅲa 期患者癌組織p27 蛋白陽性表達率低于Ⅰ、Ⅱ期，低分化患者癌組織p27 蛋白陽性表達率低于中高分化患者。見表2。

表2 不同臨床病理特征患者癌組織CyclinD1、p27蛋白陽性表達率比較 例（%）

2.3 復發(fā)和未復發(fā)患者癌組織CyclinD1、p27蛋白表達比較

患者隨訪時間平均為（2.20±0.65）年，共79 例復發(fā)，復發(fā)率為63.20%（79/125）。復發(fā)和未復發(fā)患者癌組織CyclinD1、p27 蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），復發(fā)患者癌組織CyclinD1 蛋白陽性表達率高于未復發(fā)患者，p27 蛋白陽性表達率低于未復發(fā)患者。見表3。

表3 復發(fā)和未復發(fā)患者癌組織CyclinD1、p27蛋白表達比較 例（%）

2.4 復發(fā)和未復發(fā)患者不同臨床病理特征的比較

復發(fā)和未復發(fā)患者的性別、年齡、病理類型、術(shù)式比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；復發(fā)和未復發(fā)患者的臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)清掃、術(shù)后放化療比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），臨床Ⅲa 期、低分化均高于未復發(fā)患者，淋巴結(jié)清掃、術(shù)后放化療均低于未復發(fā)患者。見表4。

表4 復發(fā)和未復發(fā)患者不同臨床病理特征的比較 例（%）

2.5 NSCLC患者術(shù)后復發(fā)的影響因素分析

將術(shù)后復發(fā)設(shè)為因變量（復發(fā)=1，未復發(fā)=0），將臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)清掃、術(shù)后放化療、癌組織CyclinD1 蛋白表達、癌組織p27 蛋白表達設(shè)為自變量，納入Cox 逐步回歸模型，α入=0.05，α出=0.10，結(jié)果：臨床Ⅲa 期[=5.818（95% CI：1.926，6.981）]、低 分 化[=6.613（95% CI：2.507，7.669）]、癌組織CyclinD1 蛋白陽性表達[=7.199（95% CI：2.147，7.958）]、癌組織p27 蛋白陰性表達[=5.339（95% CI：2.209，5.869）]是NSCLC 患者復發(fā)的獨立危險因素（P＜0.05），而淋巴結(jié)清掃[=0.477（95% CI：0.341，0.597）]、術(shù)后放化療[=0.486（95% CI：0.322，0.674）]是NSCLC 患者復發(fā)的保護因素（P＜0.05）。見表5。

表5 NSCLC患者術(shù)后復發(fā)的影響因素逐步Cox回歸分析參數(shù)

3 討論

NSCLC 的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，目前已知的病因主要包括吸煙、職業(yè)和環(huán)境接觸、肺部慢性感染病史、電離輻射、遺傳、大氣污染等，均可引起癌基因激活和抑癌基因失活，導致細胞惡性轉(zhuǎn)化[9-10]。NSCLC 患者惡性腫瘤細胞增殖活性較正常細胞顯著增強，但凋亡則顯著減少，是惡性腫瘤生長的病理基礎(chǔ)。因此，NSCLC 患者癌組織中增殖、凋亡相關(guān)調(diào)控蛋白均有不同程度異常表達，使得癌細胞增殖和凋亡失衡。研究指出[11]，NSCLC 患者術(shù)后復發(fā)的風險高，不僅與分化程度等病理特征相關(guān)，與增殖、凋亡相關(guān)調(diào)控蛋白異常表達也有緊密關(guān)聯(lián)。但是目前人們對上述問題的認識和研究尚淺，需進一步探討。

本研究癌組織CyclinD1 蛋白陽性表達率高于癌旁組織，p27 蛋白陽性表達率低于癌旁組織；Ⅲa期、低分化患者癌組織CyclinD1 蛋白陽性表達率高于Ⅰ、Ⅱ期，中高分化患者，p27 蛋白陽性表達率低于Ⅰ、Ⅱ期，中高分化患者。由此可知在NSCLC患者癌組織中CyclinD1 蛋白異常高表達，而p27 蛋白則異常低表達，兩者與臨床分期、分化程度均有密切關(guān)系，推測兩者可參與NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展。本研究術(shù)后復發(fā)率高達63.20%，低于既往ZHANG等[12]報道的40.3%，兩者不一致的可能原因是本研究研究對象的隨訪時間長、臨床Ⅲa 期占比高等。另外本研究還顯示，術(shù)后復發(fā)患者癌組織CyclinD1蛋白陽性表達率高于未復發(fā)患者，p27 蛋白陽性表達率低于未復發(fā)患者，提示癌組織CyclinD1 蛋白陽性表達、p27 蛋白陰性表達可能與NSCLC 患者術(shù)后復發(fā)的風險有關(guān)。CyclinD1 有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)許多轉(zhuǎn)錄因子及核受體影響細胞的增殖，還可調(diào)控細胞的分化程度，與惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展均有密切關(guān)聯(lián)。有研究發(fā)現(xiàn)[13]，NSCLC 患者CyclinD1 蛋白陽性表達率較良性疾病患者明顯升高，且體外實驗也證實CyclinD1 過表達可以使惡性腫瘤細胞持續(xù)增殖[14]，提示CyclinD1 蛋白陽性表達是NSCLC 發(fā)生和發(fā)展的危險因素。據(jù)此可以推測該蛋白表達水平越高，NSCLC 患者惡性腫瘤細胞的增殖活性越強，分化程度越低，在癌組織切除術(shù)后，殘端也快速惡化，細胞也可大量增殖，增加術(shù)后復發(fā)的風險。p27 蛋白在多種惡性腫瘤組織中均被證實低表達，可以調(diào)控CyclinD1，還可阻斷Rb磷酸化，促使細胞在G1 期停滯，控制細胞的增殖活性。在NSCLC 患者癌組織中p27 蛋白低表達使得對惡性腫瘤細胞增殖的控制作用減弱，可導致其迅速、大量增殖，使得腫瘤生長[15]。若p27 蛋白表達持續(xù)處于低水平，可增加疾病進展的風險，因此p27 蛋白陰性表達是NSCLC 患者術(shù)后復發(fā)的危險因素。本研究Cox 逐步回歸分析結(jié)果證實，癌組織CyclinD1 蛋白陽性表達、癌組織p27 蛋白陰性表達均是NSCLC 患者術(shù)后復發(fā)的獨立危險因素，證實兩者與該類患者術(shù)后復發(fā)風險密切相關(guān)，提示可將其作為預防復發(fā)治療的作用靶點，據(jù)此探討新的治療方案以降低術(shù)后復發(fā)率。

本研究Cox 逐步回歸分析結(jié)果還顯示，臨床Ⅲa期、低分化也是NSCLC 患者術(shù)后復發(fā)的獨立危險因素，而淋巴結(jié)清掃、術(shù)后放化療均是其保護因素，與既往國內(nèi)外報道結(jié)果一致[16-18]。分析其中可能原因：臨床分期越高，病情越嚴重，徹底切除腫瘤組織的難度越大，患者術(shù)后復發(fā)的風險也越高；低分化意味著腫瘤細胞的惡性潛能高，疾病進展的風險高，術(shù)后復發(fā)的風險也越高；淋巴結(jié)清掃可有效清除陽性淋巴結(jié)，避免惡性腫瘤細胞隨著體液播散，從而可以降低術(shù)后復發(fā)率；術(shù)后放化療可殺滅手術(shù)切除殘端的惡性腫瘤細胞及微小病灶，降低復發(fā)率。

綜上所述，NSCLC 患者癌組織中CyclinD1 蛋白陽性表達率高，p27 蛋白陽性表達率低，且與臨床分期、分化程度均有關(guān)，術(shù)后復發(fā)風險高，且術(shù)后復發(fā)患者癌組織CyclinD1 蛋白陽性表達率明顯高于未復發(fā)患者，p27 蛋白陽性表達率明顯低于未復發(fā)患者，臨床Ⅲa 期、低分化、癌組織CyclinD1 蛋白陽性表達、癌組織p27 蛋白陰性表達均是術(shù)后復發(fā)的獨立危險因素，而淋巴結(jié)清掃、術(shù)后放化療則可降低術(shù)后復發(fā)的風險。本研究為NSCLC 患者術(shù)后復發(fā)的防控提供了新方向，但如何降低癌組織中CyclinD1 蛋白陽性表達率，提高p27 蛋白表達，并積極控制其他危險因素需更進一步研究探討，可作為后期工作的重點方向。