李雯靜，黃麗雯

武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院，湖北 武漢 430064

支架內(nèi)再狹窄是經(jīng)血管介入治療后的一種常見并發(fā)癥［1］。據(jù)統(tǒng)計，在血管介入治療并成功植入藥物洗脫支架的心腦血管疾病患者中，支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率約為10%［2］。支架內(nèi)再狹窄的病理進(jìn)程中，位于血管中膜的血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的遷移和增殖發(fā)揮著重要的作用［3］。VSMC在細(xì)胞因子及炎癥因子等的誘導(dǎo)下，從血管中膜遷移至內(nèi)膜并進(jìn)行大量增殖從而引起內(nèi)膜新生是支架內(nèi)再狹窄發(fā)生的重要機(jī)制之一［4］。因此，有效抑制VSMC遷移是預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的有效方法。大蒜素是大蒜的主要活性成分，具有多種生物學(xué)活性。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素在抑制炎癥反應(yīng)及抗腫瘤細(xì)胞遷移等方面具有顯著作用［5-7］。動物實驗顯示，大蒜素可以減輕支架內(nèi)再狹窄［8-9］，但其作用機(jī)制卻未見報道。因此，本研究旨在從NF-κB信號通路出發(fā)闡明大蒜素發(fā)揮抑制血管再狹窄的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物4周齡SPF級SD雄性大鼠5只，體質(zhì)量100～140 g，購自湖北省實驗動物中心，許可證號：SCXK（鄂）2015-0018，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，溫度為25℃，相對濕度為50%，12 h光照／12 h黑暗，噪音在80 dB以下。本研究已獲得武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號：WKDTY20190703。

1.2 藥物與試劑大蒜素（純度≥98%，德國默克公司，貨號：17795-26-5）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔單克隆抗體、平滑肌細(xì)胞標(biāo)志蛋白（α-smooth muscle actin，α-SM-actin）兔多克隆抗體、極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：ST1470、P0010S、A0208、AF1186、AF0048、P0018FS）；細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所，貨號：CK04）；核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）兔單克隆抗體、p-NF-κB p65兔單克隆抗體（美國CST公司，貨號：8242、3033）；DMEM／F12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，貨號：SH30023.01）；類胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，貨號：70220-8611）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：E-EL-R2856c、E-EL-R0015c）。

1.3 儀器SW-CJ-2FD型超凈工作臺（吳江市博士凈化設(shè)備有限公司）；BXFM型顯微鏡（日本Olympus Corporation公司）；Incubator 3131型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；HNY-100D型溫控?fù)u床（長沙三利儀器儀表有限公司）；Infinite M200 Pro型酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）；Neofuge 18R型離心機(jī)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，離心半徑：9 cm）；Mini-PROTEAN Tetra型電泳儀、Mini-Trans-Blot型電轉(zhuǎn)儀、ChemiDoc MP型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、Image Lab 6.0成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Image J 1.51w軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）。

2 方法

2.1 大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)［10］所述，獲取大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞，并采用組織塊貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)，用抗大鼠α-SM-actin抗體進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，確定為VSMC。細(xì)胞純度達(dá)到95%以上的第3代至第5代VSMC用于后續(xù)實驗。

2.2 CCK-8檢測細(xì)胞活力調(diào)整VSMC密度為2.0×105mL-1，接種于96孔板中，每孔100μL。待細(xì)胞生長融合至80%時，將細(xì)胞饑餓處理24 h。采用100μL含 不 同 濃 度（5μmol·L-1、10μmol·L-1、20μmol·L-1、40μmol·L-1、60μmol·L-1、80μmol·L-1、100μmol·L-1）大蒜素或0.1%DMSO（對照組）的無血清DMEM／F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔。24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL含10% CCK-8試劑的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm處的光密度（optical density，OD）值。

2.3 細(xì)胞劃痕實驗調(diào)整VSMC密度為2.0×105mL-1，每孔1.5mL，接種于6孔板中。待細(xì)胞融合至100%時，更換無血清培養(yǎng)液饑餓處理24 h。使用1 mL的移液槍頭豎直在各組培養(yǎng)皿底壁劃一個“十”字形劃痕，使用PBS沖洗2次后在顯微鏡下拍取劃痕圖片，記為0 h劃痕。將細(xì)胞分為對照組、模型組及大蒜素組，對照組加入1.5 mL含1%類胎牛血清的培養(yǎng)液，模型組加入1.5mL含1%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS的培養(yǎng)液，大蒜素組加入1.5 mL含1%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS+40μmol·L-1大蒜素的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察相同位置，拍取劃痕圖片，記為48 h劃痕。使用Image J軟件統(tǒng)計各組劃痕面積，計算各組細(xì)胞的遷移率。實驗重復(fù)3次。

細(xì)胞遷移率＝［劃痕面積（0 h）-劃痕面積（48 h）］／劃痕面積（0 h）

2.4 Transwell實驗將VSMC分為對照組、模型組及大蒜素處理組。采用無血清培養(yǎng)液將VSMC密度調(diào)整為3.0×105mL，在Transwell培養(yǎng)板上室加入200μL細(xì)胞懸液。對照組下室加入600μL含有10%類胎牛血清FBS的培養(yǎng)液，模型組下室加入600μL含有10%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS的培養(yǎng)液，大蒜素組下室加入600μL含有10%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS+40μmol·L-1大蒜素的培養(yǎng)液。培養(yǎng)18 h后取出小室，PBS小心沖洗3次，每次5 min，將上室底部內(nèi)面未穿過的細(xì)胞輕輕擦去，4 ng·L-1多聚甲醛室溫固定15 min，PBS沖洗3次，使用1 mg·L-1DAPI在室溫下避光染色2 min，PBS洗滌后在熒光顯微鏡下拍取被染色的細(xì)胞核的代表性圖片，使用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

2.5 Western Blot檢測蛋白表達(dá)根據(jù)文獻(xiàn)［11］所述進(jìn)行操作，具體如下：將細(xì)胞分為對照組、模型組和大蒜素組，待3組細(xì)胞融合至50%時，更換無血清培養(yǎng)液饑餓處理24 h，對照組給予含10%類胎牛血清的培養(yǎng)基，模型組給予含10%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS的培養(yǎng)基，大蒜素組給予含10%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS+40μmol·L-1大蒜素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后提取各組細(xì)胞總蛋白，根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒操作說明書測定各組蛋白濃度，然后加入上樣緩沖液煮沸后備用。取等量蛋白質(zhì)進(jìn)行上樣，電泳、電轉(zhuǎn)后室溫封閉2 h。加抗NF-κB p65（1∶1 000）、抗p-NF-κB p65（1∶1 000）、抗GAPDH一抗（1∶1 000），4℃水平搖床中孵育過夜。PBST洗滌3次，每次5 min；加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶4 000），室溫孵育1～2 h。然后放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，滴加按等體積配好的化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液，打開Image Lab成像系統(tǒng)拍取圖像，通過軟件測定各蛋白條帶的灰度值，然后進(jìn)行半定量分析。

2.6 ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6含量將細(xì)胞分為對照組、模型組和大蒜素組，待三組細(xì)胞融合至50%時，更換無血清培養(yǎng)液饑餓處理24 h，對照組給予含10%類胎牛血清的培養(yǎng)基，模型組給予含10%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS的培養(yǎng)基，大蒜素組給予含10%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS+40μmol·L-1大蒜素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，4℃、3 000 r·min-1離心去除細(xì)胞碎片，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6的水平。每組設(shè)6個復(fù)孔。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 大蒜素對VSMC活力的影響與對照組比較，大蒜素濃度為80μmol·L-1和100μmol·L-1時，VSMC活力明顯減弱（P＜0.05）；當(dāng)大蒜素濃度≤60μmol·L-1時，對VSMC活力無明顯影響（P＞0.05），故本實驗選取40μmol·L-1大蒜素進(jìn)行后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 大蒜素對血管平滑肌細(xì)胞活力的影響

3.2 大蒜素對VSMC遷移的影響細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組VSMC遷移率顯著提高（P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素組VSMC遷移率明顯降低（P＜0.01）。Transwell實驗結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組穿出小室的細(xì)胞數(shù)顯著增多（P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素組穿出小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）。見圖2。

圖2 大蒜素對血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響

3.3 大蒜素對NF-κBp65和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，模型組p-NF-κB p65／NF-κB p65的水平顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素組p-NF-κB p65／NF-κB p65的水平明顯降低（P＜0.01）。見圖3。

圖3 大蒜素對各組細(xì)胞內(nèi)p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

3.4 大蒜素對VSMC培養(yǎng)液中炎癥因子水平的影響與對照組比較，模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的水平顯著降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 大蒜素對VSMC培養(yǎng)液中炎癥因子水平的影響

4 討論

持續(xù)性炎癥反應(yīng)可通過促進(jìn)VSMC的遷移和增殖在不良的血管重塑、血管增生或閉塞性疾?。ò▌用}粥樣硬化、支架內(nèi)再狹窄和靜脈移植失敗）中起關(guān)鍵作用［12］。本研究考察了大蒜素在LPS介導(dǎo)的大鼠胸主動脈VSMC遷移中的潛在作用，發(fā)現(xiàn)大蒜素可顯著抑制VSMC遷移能力，同時可明顯降低VSMC培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α和IL-6的濃度，抑制VSMC內(nèi)NF-κB p65磷酸比。

經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)、支架植入術(shù)及搭橋術(shù)等在內(nèi)的介入或外科手術(shù)均可通過恢復(fù)嚴(yán)重狹窄或閉塞血管的血供有效改善患者預(yù)后［13-14］。然而，隨著術(shù)后時間的延長，機(jī)體的炎癥反應(yīng)及其誘導(dǎo)的VSMC遷移至血管內(nèi)膜并大量增殖常會導(dǎo)致血管再次狹窄甚至重新閉塞［15-17］。研究顯示，血管壁的損傷可誘導(dǎo)多種促細(xì)胞遷移的炎癥介質(zhì)表達(dá)，而有效抑制血管壁損傷后的炎癥反應(yīng)，可明顯減弱血管內(nèi)VSMC遷移至內(nèi)膜及過度增殖，從而起到抑制內(nèi)膜新生的作用，降低血管再狹窄或閉塞的發(fā)生率［18-19］。

大量研究證實，VSMC過度遷移至內(nèi)膜是導(dǎo)致血管再狹窄的重要因素［20-22］。因此，準(zhǔn)確檢測VSMC細(xì)胞的遷移能力對判定血管再狹窄具有重要意義。目前，關(guān)于檢測VSMC遷移水平的方法有很多，最常用的是細(xì)胞劃痕實驗和Transwell實驗。本研究中，通過細(xì)胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測發(fā)現(xiàn)，VSMC細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后其遷移能力明顯增強(qiáng)，而大蒜素可明顯減弱VSMC細(xì)胞的遷移能力。推測大蒜素對VSMC遷移引起的血管再狹窄具有緩解作用。

NF-κB信號通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路［23-25］，NF-κB蛋白常以p65和p50亞基形成同源／異源二聚體的形式存在，并在細(xì)胞質(zhì)中與抑制蛋白IκB結(jié)合形成三聚體復(fù)合物而處于失活狀態(tài)［26］。當(dāng)受到炎癥相關(guān)誘導(dǎo)因素刺激后，信號將傳遞給IKK激酶（IκB kinase），使IκB蛋白磷酸化并從三聚體中解離出來，NF-κB二聚體暴露出核定位序列并被磷酸化，并迅速從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與核內(nèi)DNA上的特異序列結(jié)合，促進(jìn)炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如TNF-α和IL-6等［27-28］。研究顯示，NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與血管再狹窄的發(fā)生和病理進(jìn)展［29-30］，在損傷的大鼠血管增生內(nèi)膜中可檢測到NF-κB活性增強(qiáng)［31］。抑制NF-κB信號通路活性可減輕VSMC及血管內(nèi)膜炎癥反應(yīng)，并最終抑制損傷血管再狹窄的嚴(yán)重程度［3］。本研究顯示，體外LPS誘導(dǎo)后，VSMC中NF-κB p65的磷酸化水平顯著升高，并增加其下游炎癥因子（包括IL-6，TNF-α）的表達(dá)，同時VSMC遷移活性也增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在VSMC遷移中起重要作用。此外，我們在LPS刺激的基礎(chǔ)上加入大蒜素處理VSMC后發(fā)現(xiàn)，大蒜素的干預(yù)可降低NF-κB p65磷酸化，同時炎癥因子（包括IL-6，TNF-α）的表達(dá)減弱；進(jìn)一步檢測VSMC的遷移活性發(fā)現(xiàn)，VSMC的遷移受到抑制。

綜上，大蒜素可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移，其作用機(jī)制與抑制NF-κB p65的磷酸化相關(guān)。