吳發(fā)勝，周堯紅，何錦軼，李洲強(qiáng)，陳曉宇，陳慧，練祖平，侯恩存

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升，2018年全球新診斷乳腺癌患者約210萬(wàn)例，占所有新診斷癌癥病例的24.2%，占所有與癌癥相關(guān)女性病死率的15%［1］，在女性惡性腫瘤中的病死率僅次于肺癌。近年來(lái)，臨床對(duì)乳腺癌的治療也越來(lái)越重視。中藥具有療效顯著、不良反應(yīng)小的特點(diǎn)，故在癌癥領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。

枳實(shí)是蕓香科酸橙及其栽培品種或甜橙的干燥幼果，具有破氣消積、化痰消痞的功效，且有“非枳實(shí)不能消痞”一說(shuō)。臨床上枳實(shí)被用于治療諸多疾?。?-6］。枳實(shí)含有多種有效成分和作用的靶點(diǎn)，但由于其潛在的活性成分及在乳腺癌治療中的作用機(jī)制尚不清楚，故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，進(jìn)一步探討枳實(shí)治療乳腺癌的機(jī)制，并為其應(yīng)用于腫瘤疾病提供一定思路。

1 材料與方法

1.1 枳實(shí)活性化合物收集與篩選采用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）（http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）進(jìn)行研究，以藥物生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件篩選枳實(shí)的活性化合物。

1.2 枳實(shí)化合物靶點(diǎn)收集將1.1中篩選出的活性化合物通過(guò)導(dǎo)入Drug Bank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／www.drugbank.ca／），進(jìn)一步得到枳實(shí)化合物對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。

1.3 枳實(shí)化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建篩選出不重復(fù)的靶點(diǎn)，使用String數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入靶點(diǎn)名稱，并將物種限制為人類，最終得到所需靶點(diǎn)，利用Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建枳實(shí)的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)的獲取以“breast cancer”為檢索詞，使用Gene Cards（https：／／www.genecards.org／）、CTD（http：／／ctd.mdibl.org／）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到乳腺癌的所有靶點(diǎn)，構(gòu)建疾病數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選并剔除重復(fù)后得到目標(biāo)靶點(diǎn)基因。

1.5 藥物-疾病共同靶點(diǎn)的篩選及構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖利用Venn在線分析工具獲得枳實(shí)和乳腺癌共同交集的靶點(diǎn)，并用Cytoscape3.7.2軟件制作靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析

利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)枳實(shí)作用于乳腺癌的靶蛋白進(jìn)行GO功能富集分析，包括生物功能（biological function，BP）、細(xì)胞組分（cell composition，CC）、分子功能（molecular function，MF）?？梢暬治鲨讓?shí)作用于乳腺癌的靶點(diǎn)GO功能富集結(jié)果。

1.7 京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopaedia of gene and genomes，KEGG）通路富集分析

進(jìn)入DAVID平臺(tái)，利用其中的KEGG通路富集分析功能，對(duì)枳實(shí)作用于乳腺癌靶點(diǎn)相關(guān)的43個(gè)蛋白質(zhì)功能進(jìn)行深入研究，結(jié)果得到共103條信號(hào)通路，將此導(dǎo)入omicshare（http：／／www.omicshare.com／）處理平臺(tái)進(jìn)行可視化分析。

1.8 分子對(duì)接通過(guò)TCMSP獲得活性成分mol2格式，采用RCSB PDB（http：／／www.rcsb.org／）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相關(guān)蛋白晶體結(jié)構(gòu)，保存為pdb格式，應(yīng)用AutoDock軟件進(jìn)行分子對(duì)接。根據(jù)得到的binding energy的值評(píng)價(jià)活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 枳實(shí)活性化合物的篩選利用TCMSP軟件檢索枳實(shí)中的活性化合物共65個(gè)，在藥物標(biāo)準(zhǔn)OB≥30%和DL≥0.18的條件下篩選出22個(gè)化合物，包括：枸橘苷（poncirin）、異橙黃酮（Isosinensetin）、5，7，4'-三甲氧基黃酮（5，7，4'-Trimethylapigenin）、異櫻花素-7-蕓香糖苷（isosakuranetin-7-rutinoside）、獨(dú)活素（Prangenin）、白芷屬腦（prangenin hydrate）等。各化合物的OB和DL值見表1。

2.2 枳實(shí)化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)將枳實(shí)化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，去除非人源蛋白和重復(fù)蛋白，得到兩者之間更直觀的相互作用，最后通過(guò)整合獲得116個(gè)靶點(diǎn)。其中表1中poncirin（MOL013276）、prangenin hydrate（MOL013433）和Obacunone（MOL013352）這3個(gè)成分沒有相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。再次利用Cytoscape軟件，構(gòu)建枳實(shí)化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，在網(wǎng)絡(luò)圖中有135個(gè)節(jié)點(diǎn)274條相互關(guān)系，見圖1。

圖1 枳實(shí)化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表1 枳實(shí)22個(gè)活性成分信息

2.3 枳實(shí)治療乳腺癌的作用靶點(diǎn)在Gene Cards（https：／／www.GeneCards.org／）、CTD（http：／／ctd.mdibl.org／）數(shù)據(jù)庫(kù)中收集乳腺癌靶點(diǎn)，剔除重復(fù)數(shù)據(jù)后得到449個(gè)。利用Venn分析工具，繪制枳實(shí)化學(xué)成分與乳腺癌發(fā)病相關(guān)的靶點(diǎn)韋恩圖，見圖2，共有43個(gè)靶點(diǎn)基因，分別為MMP2、NOS2、MET、IL-10、MAPK1、BIRC5、MDM2、EGFR、IL-2、CREB1、ERBB2、IFNG、CHEK1、BCL2、TOP2A、MAPK8、BCL2L1、MAPK3、PPARG、RELA、GSTP1、RB1、CDK2、CYP19A1、TP53、INSR、CASP9、CDKN1A、CAT、AKT1、XIAP、PTGS2、CCND1、ESR1、CDK4、VEGFA、JUN、ESR2、BAX、MMP1、IL6、CASP3、MMP9。

圖2 枳實(shí)-乳腺癌靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 枳實(shí)治療乳腺癌的作用靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)將韋恩圖中交集的43個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖3。圖中共有43個(gè)節(jié)點(diǎn)，579條邊，其中Degree值較大者是TP53、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA、CCND1、MAPK1，表明這些蛋白是枳實(shí)治療乳腺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白。

圖3 枳實(shí)治療乳腺癌作用靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.5 枳實(shí)治療乳腺癌靶點(diǎn)GO功能富集分析GO功能富集分析，得出317條BP，主要包括轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的正調(diào)控、細(xì)胞增殖和一氧化氮生物合成過(guò)程的正向調(diào)控、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、藥物反應(yīng)、毒性反應(yīng)等；有34條CC，包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜微囊、胞液、線粒體、周期蛋白依賴的蛋白激酶全酶復(fù)合物等；有62條MF，包括蛋白質(zhì)異構(gòu)化活性、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、激酶活性、蛋白質(zhì)同源二聚活性、BH3域綁定等。根據(jù)P值由小到大選取排名前10位的條目，通過(guò)GraphPad 8.4.0軟件做出了BP、CC、MF的條形圖，見圖4。

圖4 枳實(shí)治療乳腺癌靶點(diǎn)的GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析和氣泡圖富集結(jié)果分析，枳實(shí)治療乳腺癌共有103條通路，其中有癌癥通路（Pathways in cancer）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3KAkt signaling pathway）、HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、FoxO信號(hào)通路（FoxO signaling pathway）、p53信號(hào)通路（p53 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）等。排除“Hepatitis B”“Bladder cancer”“Pancreatic cancer”等與乳腺癌不相關(guān)的通路，根據(jù)P值，從小到大選擇前20個(gè)的通路，將其導(dǎo)入omicshare平臺(tái)，制作高級(jí)氣泡圖，見圖5。

圖5 枳實(shí)治療乳腺癌作用靶點(diǎn)KEGG通路富集分析氣泡圖

2.7 KEGG通路富集分析圖利用KEGG分析，將2.6中得到的103條通路按P值大小選取前20條信號(hào)通路。點(diǎn)擊PI3K-Akt信號(hào)通路Chart，見圖6。

圖6 枳實(shí)中PI3K-Akt信號(hào)通路潛在靶基因的KEGG通路富集分析

2.8 分子對(duì)接驗(yàn)證選取“枳實(shí)化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”圖中排名前3位的化合物luteolin、naringenin、nobiletin與PPI網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值排名靠前的8個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)TP53、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA、CCND1、MAPK1、MAPK3，利用AutoDock軟件進(jìn)行分子對(duì)接。其中naringenin與AKT1、CASP3、MAPK1對(duì)接以及nobiletin與TP53、AKT1、JUN、VEGFA、CCND1、MAPK1對(duì)接的能量大于-5 kcal·mol-1，其余對(duì)接結(jié)果均小于-5 kcal·mol-1，證明枳實(shí)化合物活性成分和靶蛋白結(jié)合穩(wěn)定，見表2。利用Pymol軟件對(duì)活性化合物與luteolin結(jié)果進(jìn)行可視化處理，見圖7。

圖7 分子對(duì)接模式圖

表2 枳實(shí)化合物活性成分和靶蛋白對(duì)接結(jié)果

3 討論

乳腺癌屬中醫(yī)“乳巖”“乳石癰”“石癰”等范疇。《醫(yī)宗金鑒》提出“堅(jiān)硬巖行引胸腋”，同時(shí)指出乳巖是由肝脾兩傷和氣郁凝結(jié)而成的。乳巖辨證以痰瘀互結(jié)證、肝氣瘀滯證最為常見［7］，治療需標(biāo)本兼顧，治以疏肝理氣、活血利水。枳實(shí)為常用中藥材，其味辛、苦，性微寒?！毒霸廊珪分需讓?shí)的功效是“除脹滿，消宿食，削堅(jiān)積，化稠痰，破滯氣，平咳喘，逐瘀血停水，解傷寒結(jié)胸，去胃中濕熱”［8］。研究表明，枳實(shí)具有促動(dòng)力［9］、抗氧化、抗炎［10-11］、抗凝［12］、抗腫瘤、增強(qiáng)細(xì)胞免疫［13］等多種活性。目前，未檢索到有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)枳實(shí)治療乳腺癌的活性成分、作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路等作用機(jī)制的研究。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺(tái)，構(gòu)建枳實(shí)化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)枳實(shí)治療乳腺癌的靶點(diǎn)進(jìn)行了GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析，進(jìn)一步分析枳實(shí)治療乳腺癌的機(jī)制。

本研究檢索到枳實(shí)活性成分19個(gè)，有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分16個(gè)，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)枳實(shí)主要通過(guò)neohesperidin-qt、luteolin、nobiletin、naringenin、Sinensetin、Tetramethoxyluteolin等有效成分發(fā)揮藥理學(xué)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，neohesperidin-qt（新橙皮苷）可以誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡［14］。王宏［15］、劉俊磊［16］的實(shí)驗(yàn)表明，新橙皮苷有很好的體內(nèi)外抗腫瘤和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，聯(lián)合用藥下調(diào)了MAPK信號(hào)通路的磷酸化活化程度以及Bcl-2和p-AKT表達(dá)水平，使核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)降低。另外，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中橙皮素抑制CYP1A1和CYP1B表達(dá)，刺激INSIG1表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮了抗腫瘤的作用。木犀草素已被證實(shí)，可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Zhang等［17］發(fā)現(xiàn)，拉帕替尼和木犀草素聯(lián)合應(yīng)用可以通過(guò)提高HER2人乳腺癌移植瘤中兩個(gè)關(guān)鍵基因FOXO3a和NQO1的表達(dá)以抑制HER2人乳腺癌。由此推斷，枳實(shí)應(yīng)用于機(jī)體后，它的一些有效成分在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演了重要角色。

Venn分析得到枳實(shí)與乳腺癌相關(guān)的43個(gè)潛在靶點(diǎn)，用Cytoscape軟件可視化，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，圖中顯示Degree值較大者是TP53、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA、CCND1、MAPK1，說(shuō)明它們是藥物與疾病相互作用的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。TP53基因改變是最普遍的［18］，它是17號(hào)染色體的基因，這是一個(gè)十分重要的癌癥風(fēng)險(xiǎn)因素。TP53是一種轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)細(xì)胞在應(yīng)激反應(yīng)中被激活時(shí)，調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞過(guò)程相關(guān)的基因，包括細(xì)胞周期、凋亡及衰老［19］。研究證實(shí)，受TP53直接調(diào)控的miR-34a在乳腺癌、肺癌、肝癌等組織中均有異常的表達(dá)，其對(duì)腫瘤增殖有負(fù)性調(diào)控作用，可直接抑制乳腺癌和大腸癌中的乳酸脫氫酶A的表達(dá)［20］。在含有TP53錯(cuò)義突變的癌細(xì)胞系中，APR-246通過(guò)ROS誘導(dǎo)p73和Noxa表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)顯著凋亡［21］。作為高突變率的AKT1基因在腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中亦起著重要的作用。Li等［22］研究發(fā)現(xiàn)，Akt1基因敲除可刺激βcatenin核聚集，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞侵襲，吉非替尼可潛在地抑制Akt1抑制誘導(dǎo)的乳腺癌轉(zhuǎn)移。由此，我們?cè)谂R床上可根據(jù)乳腺癌相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，針對(duì)性用藥，可為將來(lái)發(fā)現(xiàn)新型的治療藥物提供依據(jù)。為了進(jìn)一步研究枳實(shí)治療乳腺癌的作用，利用AutoDock軟件做分子對(duì)接，結(jié)果顯示枳實(shí)對(duì)乳腺癌的多個(gè)作用靶點(diǎn)和有效活性成分對(duì)接的binding energy小于-5 kcal·mol-1，證明枳實(shí)能與乳腺癌受體蛋白穩(wěn)定結(jié)合并發(fā)揮重要作用。

本研究對(duì)枳實(shí)治療乳腺癌的靶基因進(jìn)行了GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，治療的生物過(guò)程中，主要體現(xiàn)在細(xì)胞增殖、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、一氧化氮生物合成過(guò)程、凋亡過(guò)程、有毒物質(zhì)反應(yīng)等方面，還包括酶結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)異構(gòu)化活性、激酶活性等分子功能。根據(jù)KEGG通路富集分析，枳實(shí)與乳腺癌最相關(guān)的通路包括PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、p53信號(hào)通路和雌激素信號(hào)通路。Yurasakpong等［23］發(fā)現(xiàn)，枳實(shí)提取物通過(guò)阻斷Akt／mTOR／HIF-1軸減少己糖激酶Ⅱ的表達(dá)，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡。PI3K-Akt信號(hào)通路作用顯著，腫瘤的發(fā)生、增殖、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡過(guò)程中均起重要作用［24］。通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路可以干擾乳腺癌增殖和侵襲的能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［25-26］，并且與化療還有協(xié)同作用，抑制癌細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性［27］。PI3K-Akt信號(hào)通路的靶向治療逐漸成為乳腺癌治療的熱點(diǎn)。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，對(duì)枳實(shí)治療乳腺癌的多成分、多靶點(diǎn)、多通路機(jī)制進(jìn)行了研究，可體現(xiàn)出中藥治療疾病的復(fù)雜性。由于在研究的過(guò)程中可能存在數(shù)據(jù)庫(kù)資料收集不全面、篩選不夠精準(zhǔn)等不足之處，故本研究初步探討了枳實(shí)治療乳腺癌的藥理機(jī)制，通過(guò)生物信息學(xué)等技術(shù)探究了中藥與疾病的潛在作用靶點(diǎn)及機(jī)制。