杜志鵬，楊彥勇，蔡建明，

1.溫州醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生與管理學院，浙江 溫州 325035；2.中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學 海軍醫(yī)學系艦船輻射醫(yī)學防護教研室，上海 200433

DNA復制是DNA聚合酶采用半保留的方式合成雙鏈DNA（double-stranded DNA, dsDNA）的過程，而基因轉(zhuǎn)錄則是RNA聚合酶利用dsDNA中的一條鏈為模板合成RNA的過程。R環(huán)是當RNA鏈侵入dsDNA時形成的核酸結(jié)構(gòu)。在復制過程中，DNA會解開雙螺旋，因5’→3’方向的鏈不能連續(xù)合成新鏈，此時5’→3’方向的模板鏈上會出現(xiàn)單鏈DNA（single-stranded DNA, ssDNA），給R環(huán)的形成創(chuàng)造了機會。在細胞中，R環(huán)還會阻礙復制叉的進行，影響DNA的正常復制，進而影響基因組的穩(wěn)定性[1]。在DNA轉(zhuǎn)錄時，RNA聚合酶解繞DNA并合成5’→3’方向的RNA鏈，這會在前進的RNA聚合酶后面產(chǎn)生負超螺旋，促進R環(huán)的形成。dsDNA R環(huán)的形成和調(diào)控具有復雜的生物學機制，在生物進化中產(chǎn)生了多種途徑來減少R環(huán)對基因組穩(wěn)定性的影響。本篇綜述圍繞R環(huán)的產(chǎn)生、修復的影響因素及主要機制，以及其在腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展治療中的作用和應用前景進行討論。

1 R環(huán)的形成與常用檢測方法

1.1 R環(huán)的定義 R環(huán)是指在轉(zhuǎn)錄過程中，某些基因轉(zhuǎn)錄mRNA難與模板鏈分離時，由mRNA取代非模板鏈，形成由互補的DNA模板鏈上的RNA雜合體和非模板鏈上的ssDNA組成的三鏈裸露環(huán)，為非B DNA結(jié)構(gòu)。通常，R環(huán)在伸長的RNA聚合酶后面形成，偶爾也會在新生RNA與聚合酶前面的DNA模板雜交，產(chǎn)生前R環(huán)[2]。

1.2 R環(huán)的分類 R環(huán)有兩種類型：生理性和病理性R環(huán)。生理性R環(huán)通常依賴于需要特定因素的程序化過程來保證它們的形成；病理性R環(huán)以非預定方式意外發(fā)生。

生理性R環(huán)作為特定細胞過程中的關(guān)鍵中間體自然形成，例如基因表達調(diào)控、DNA損傷修復、免疫球蛋白類轉(zhuǎn)換重組（immunoglobulin class switch recombination, CSR）、大腸桿菌質(zhì)粒復制和線粒體DNA復制等。R環(huán)參與的主要生理學過程包括：①基因表達調(diào)控。一些哺乳動物基因3’端的R環(huán)可以幫助RNA聚合酶停止轉(zhuǎn)錄[3]，從而參與基因的表達調(diào)控。②DNA損傷修復。DNA損傷修復主要包括同源重組（homologous recombination, HR）以及非同源末端連接（non-homologous end joining, NHEJ）。R環(huán)會影響復制蛋白A（replication protein A, RPA）蛋白的招募，過多或者過少的R環(huán)均會引起HR修復的異常[4]。③CSR。在一項理論中，穩(wěn)定的R環(huán)結(jié)構(gòu)為激活誘導的胞苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase, AID）提供了ssDNA底物，以啟動CSR過程[5]。AID將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，當被堿基切除修復機器處理時會導致DNA切口。當錯配修復蛋白作用于該DNA缺口時，會導致dsDNA斷裂。最后，末端連接DNA修復導致Ig類轉(zhuǎn)換。見表1。

表1 R環(huán)在不同生物學過程中起的作用

病理性R環(huán)的形成頻率異于一般R環(huán)的形成頻率，并且可能會影響基因表達和基因組的完整性。病理性R環(huán)常見于以下環(huán)節(jié)：①R環(huán)參與復制叉沖突過程。在基因復制時會形成復制叉。R環(huán)可能會在復制叉沖突期間誘導DNA斷裂造成DNA損傷[6]。②R環(huán)參與DNA錯誤切除。轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)核苷酸切除修復（transcription-coupled nucleotide excision repair, TC-NER）能去除轉(zhuǎn)錄阻斷、龐大的DNA損傷，TC-NER核酸酶XPG和XPF可以切除阻止轉(zhuǎn)錄的R環(huán)，留下一個ssDNA缺口，導致DNA斷裂[7]。③R環(huán)參與DNA雙鏈斷裂（DNA double strand break, DSB）修復。持續(xù)存在的R環(huán)會阻礙DNA修復因子與DSB的結(jié)合[8]，并導致異常修復。

研究表明，R環(huán)可能與一些起點識別復合物共定位于復制起點，參與大腸桿菌線粒體的復制[9]。此外，R環(huán)容易在細菌DNA中的負超螺旋或在真核生物中暫時于RNA聚合酶后面的負超螺旋處生成。R環(huán)形成時會吸收負超螺旋的能量，從而使DNA纖維恢復到能量更低的部分或完全松弛狀態(tài)。具有更有利的堿基配對特性的R環(huán)需要較少的DNA弛豫能量，而在較不利的區(qū)域上形成R環(huán)則需要更強的負超螺旋，以助其形成和穩(wěn)定[10]。DNA促旋酶具有將負超螺旋引入DNA的能力，是轉(zhuǎn)錄相關(guān)的超負超螺旋和R環(huán)形成的主要驅(qū)動力[11]。

1.3 R環(huán)的常用檢測方法

1.3.1 電泳技術(shù)：自1976年R環(huán)被首次描述[12]，研究者們已經(jīng)開發(fā)了多種技術(shù)研究真核生物的R環(huán)。在這些技術(shù)中，比較經(jīng)典的就是電泳技術(shù)。R環(huán)結(jié)構(gòu)在瓊脂糖凝膠電泳中遷移的速度較慢，并且在體外轉(zhuǎn)錄后可以用溴化乙錠（EtBr）觀察[5，13]。電泳中的條帶表現(xiàn)出對RNase A的抗性和對RNase H1的敏感性，據(jù)此可以利用RNase A提高R環(huán)的濃度。由于EtBr是一種強誘變劑，可致畸和致癌，在后續(xù)的R環(huán)檢測技術(shù)發(fā)展成熟后，凝膠電泳檢測R環(huán)的技術(shù)逐漸被淘汰。

1.3.2 DNA-RNA免疫沉淀技術(shù)

1.3.2.1 DRIP-seq技術(shù)：在1986年，一種強大的全基因組技術(shù)DRIP-seq被報道用于R環(huán)的檢測，該技術(shù)使用S9.6抗體沉淀DNA-RNA雜交體，然后進行高通量測序，從而鑒定R環(huán)的結(jié)構(gòu)和序列信息[14]。DRIP-seq在技術(shù)上要求較低，需要的起始原料較少，耗時較少，卻可提供有關(guān)基因組中R環(huán)分布的有用且可靠的信息，但是它的分辨率有限，并且不提供有關(guān)特異鏈的信息。

1.3.2.2 DRIPc-seq技術(shù)：有研究者在DRIP-seq技術(shù)的基礎上研發(fā)了新的檢測方法，其中一種是名為DRIPc-seq的技術(shù)，這是一種近堿基對分辨率和鏈特異性的方法，可在任何細胞群體中準確定位R 環(huán)[15]。由于DRIPc-seq信號絕大多數(shù)是鏈特異性的，因此對核糖核酸酶H（ribonuclease H, RNase H）預處理非常敏感，以致于無法在免疫沉淀之前從經(jīng)過RNase H處理的樣品中建立測序文庫[16]。另外，細胞中短的R環(huán)序列是不太穩(wěn)定的，而且抗體可能會以高特異性沉淀結(jié)合更長的R環(huán)結(jié)構(gòu)域[17]。

1.3.2.3 ssDRIP-seq技術(shù)：ssDRIP-seq技術(shù)是一種基于ssDNA連接的文庫制備技術(shù)，用于R環(huán)的全基因組鑒定。與DRIPc-seq方法相比，它可以區(qū)分特定的DNA鏈，并且ssDRIP-seq需要更少的文庫構(gòu)建步驟。當在擬南芥中使用時，ssDRIP-seq表現(xiàn)出高效率、低偏差和鏈特異性，并且利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)了擬南芥中一個先前未檢測到的R環(huán)[18]。

1.3.3 其他方法：此外，還有一些方法，例如通過成像和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）方法將R環(huán)可視化[19]。通過檢測R環(huán)相關(guān)蛋白來研究R環(huán)的方法，如用免疫熒光法檢測RNA解旋酶DExH-box解旋酶9（DExH-box helicase 9, DHX9）[20]。作為鑒定dsDNA螺旋中擾動的方法，亞硫酸氫鹽修飾可用于檢測R環(huán)[5]。

2 影響R環(huán)形成的因素

細胞通過3種不同類型的因素保護基因組免受病理性R環(huán)積累的影響：①阻止R環(huán)形成的因素，在大多數(shù)情況下是RNA結(jié)合和加工因子，以及染色質(zhì)重塑劑；②去除R環(huán)的因素，例如核糖核酸酶和DNA-RNA解旋蛋白；③在修復或復制過程中直接或間接幫助去除R環(huán)的DNA修復因子。

2.1 促進R環(huán)形成的因素

2.1.1 促進生理性R環(huán)的因子：R環(huán)是調(diào)節(jié)基因組動力學多個過程所需要的中間體，它參與了基因的復制、轉(zhuǎn)錄以及其他許多生理過程，因此促進生理性R環(huán)的形成對于細胞正常的生理活動具有十分重要的意義。例如，在基因轉(zhuǎn)錄和表達中，在CpG島上形成的R環(huán)保護這些區(qū)域免受DNA甲基化的影響，最終避免了轉(zhuǎn)錄沉默。細胞中CSR[5]存在也會促進R環(huán)的形成。受刺激的B細胞中S區(qū)的轉(zhuǎn)錄，促進了R環(huán)的形成，最終促進Ig類別轉(zhuǎn)換。在DNA損傷修復過程中，MRN復合體（MRE11-RAD50-NBS1）啟動的DSB切除可導致斷裂處的瞬時R環(huán)形成，從而在調(diào)節(jié)HR修復中發(fā)揮作用[21-22]。低滲脅迫誘導核仁中核糖體基因的轉(zhuǎn)錄促進了R環(huán)的穩(wěn)定形成，從而產(chǎn)生了被RPA包裹的ssDNA片段。這導致募集至核仁的共濟失調(diào)毛細血管擴張突變基因Rad3相關(guān)蛋白（aataxiatelangiectasia mutated and Rad 3 related protein, ATR）被激活，最終觸發(fā)DNA損傷修復[23]。 細胞中整合的應激反應（integrated stress response, ISR）會阻斷組蛋白的合成，促進R環(huán)的形成。在ISR環(huán)境中，組蛋白的缺失和R環(huán)的形成共同介導了DNA合成的快速中止，防止?jié)撛诘挠泻NA復制[1]。細菌中的應激誘導的誘變（stress-induced mutagenesis, SIM）由DSBs/DSEs（double strand breaks or ends）觸發(fā)，涉及使用易錯（誘變）聚合酶Pol IV、II和V進行復制。在壓力條件下，一些復制從R環(huán)開始，在遇到ssDNA切口時，復制叉崩潰會產(chǎn)生DSB，從而促進細菌的SIM，最終幫助細菌適應壓力[24-25]。酵母細胞中GAL為響應環(huán)境變化的基因，通過lncRNA誘導R環(huán)的形成來暫時調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活從而快速響應環(huán)境變化[26]。

2.1.2 促進病理性R環(huán)的因素：能夠增加RNA和DNA接觸機會的因素會促進R環(huán)的形成，例如非模板DNA鏈斷裂[27-28]，負超螺旋（有利于DNA展開）[27，29]，阻礙非模板DNA鏈的非規(guī)范DNA結(jié)構(gòu)（例如G4-四鏈體和三鏈體）[30]，非模板DNA鏈的螯合配體[31]或者空間上游離RNA末端的接近等[32]。在尤文氏肉瘤中，EWS-FLI1蛋白調(diào)節(jié)RNA聚合酶II（RNA polymerase II, RNAPII）延伸并與剪接機制相互作用促進了R環(huán)的形成，阻斷尤文氏肉瘤的乳腺癌基因1（breast cancer 1, BRCA1）修復，部分介導了尤文氏肉瘤對化療的敏感性[33]。

2.2 抑制R環(huán)形成的因子 病理性的R環(huán)是危險結(jié)構(gòu)，可能會對轉(zhuǎn)錄延伸產(chǎn)生負面影響并嚴重損害基因組完整性，是超突變、超重組、染色體重排或染色體丟失的潛在來源。這種威脅使得細胞進化出不同的因子和機制來防止共轉(zhuǎn)錄R環(huán)的形成或去除RNA：DNA雜交[34]。

2.2.1 引物酶-聚合酶PrimPol與R環(huán)：PrimPol屬于AEP超級家族，是一種具有合成DNA引物的獨特能力，以及能夠繞過某些DNA病變的非過程DNA聚合酶。繞過DNA病變的能力賦予了細胞DNA損傷耐受性，這對于存在未修復DNA損傷的情況下支持持續(xù)的復制體進展至關(guān)重要。無法忍受這種損害會導致復制叉長時間停滯、崩潰，并最終導致基因組不穩(wěn)定和（或）細胞死亡。GAA重復序列和許多其他引起疾病的串聯(lián)重復序列可以形成DNA二級結(jié)構(gòu)，例如發(fā)夾、三鏈體（H-DNA）或G-四鏈體（G4）。不參與這些結(jié)構(gòu)形成的DNA鏈暴露為ssDNA。該暴露的ssDNA易于與互補RNA轉(zhuǎn)錄物雜交，從而導致R環(huán)的形成[35]。PrimPol通過發(fā)揮其跨病變合成和引發(fā)酶的作用，繞過DNA損傷下游、G4二級結(jié)構(gòu)和鏈終止核苷酸類似物等DNA損傷位點[36]，重新啟動DNA復制，防止復制過程中過量的ssDNA暴露，從而限制了這些序列附近的R環(huán)積累（見圖1）。PrimPol的缺失會導致人細胞DNA二級結(jié)構(gòu)附近R環(huán)形成的增加，增加了細胞內(nèi)部的轉(zhuǎn)錄-復制沖突風險，最終導致基因組的不穩(wěn)定[37]。

圖1 PrimPol預防R環(huán)的形成

2.2.2 范可尼貧血（Fanconi anemia, FA）相關(guān)蛋白與R環(huán)：FA途徑下有許多蛋白參與調(diào)節(jié)R環(huán)，保護基因組的穩(wěn)定性。研究表明，F(xiàn)A途徑下的范可尼貧血組D2蛋白（Fanconi anemia group D2 protein,FANCD2）在R環(huán)形成過程中具有保護作用[38-39]。R環(huán)的形成促進了FANCD2在大型脆弱基因上的積累[39]。 FANCD2能募集RNA處理酶，包括異質(zhì)核核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U,hnRNPU）和DEAD-box解旋酶47（DEAD-box helicase 47, DDX47）。hnRNPU是一種RNA結(jié)合蛋白，在轉(zhuǎn)錄延長pre-mRNA剪接、mRNA穩(wěn)定性以及更廣泛的間期染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中起作用。FANCD2可能通過將hnRNPU定位于R環(huán)形成的位點，促進巨大的易碎基因基因座上的pre-mRNA剪接[38]。DDX47為DEAD框蛋白家族的腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate, ATP）依賴性RNA解旋酶，可以解開DNA:RNA雜合體破壞R環(huán)[39]（見圖2）。除了FANCD2外，F(xiàn)A途徑的范可尼貧血組D1蛋白（Fanconi anemia group D1 protein,FANCD1）成員乳腺癌基因2（breast cancer 2,BRCA2）也能防止R環(huán)的積累[40]。BRCA2與RNAPII相互作用，以調(diào)節(jié)啟動子近端暫停（promoter proximal pause, PPP）位點釋放，同時募集RNase H2促進R環(huán)的去除[22]（見圖2），從而防止病理性的R環(huán)積累[41]。FA途徑下還有一部分因子參與調(diào)控R環(huán)，例如BRCA1通過募集肌萎縮側(cè)索硬化癥相關(guān)蛋白（senataxin,SETX）解旋酶參與調(diào)控與轉(zhuǎn)錄終止相關(guān)的R環(huán)[42]。最近有研究表明，MRN可以促進FA途徑內(nèi)的關(guān)鍵抗R環(huán)蛋白范可尼貧血互補群M（FA complementation group M, FANCM）有效地募集到細胞中R環(huán)易發(fā)位 點[43]。

圖2 以FANCD2和BRCA2為例的兩種抑制R環(huán)形成的途徑

2.2.3 RNase H與R環(huán)：真核細胞具有單體H1和異源三聚體H2兩種類型的RNase H酶，它們專門用于消除基因組中的RNA-DNA雜交[44]。RNase H1和RNase H2利用5’→3’核酸外切酶活性從環(huán)中去除RNA。這些酶在原核生物和真核生物中在進化上是保守的，并且是消化雜交RNA的唯一已知的RNA特異性核糖核酸酶[45]。多個研究表明，RNase H可以促進R環(huán)的去除[23，46-49]。在許多的研究中利用RNase H酶的特性，通過過表達RNase H來特異性地去除R環(huán)或者驗證R環(huán)的存在[2，16，20，26，32，50]。

還有一些因子與R環(huán)的關(guān)系比較復雜。DHX9雖然可以促進病理性和非病理性R環(huán)的形成[20]，但在一些情況下也會抑制R環(huán)的形成，例如DHX9促進喜樹堿處理的細胞中轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域的R環(huán)抑制，并防止R環(huán)相關(guān)的DNA損傷[51]。此外，MRN與R環(huán)的關(guān)系也存在兩面性[43]。

2.3 R環(huán)與DNA損傷

首先R環(huán)是一種DNA損傷引發(fā)劑，它能在復制和轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)誘導DNA損傷。在復制過程中，復制叉前形成的R環(huán)可能會阻礙復制體的進程，從而導致復制叉的崩潰或斷裂，產(chǎn)生DNA損傷[1，44]。R環(huán)還會引起轉(zhuǎn)錄-復制碰撞，從而導致DNA損傷和基因組不穩(wěn)定[52]。其次，R環(huán)可能作為中間體導致了DNA的損 傷，例如G4配體對DNA的損傷由R環(huán)介導。

R環(huán)對DNA損傷的影響不僅僅體現(xiàn)在對DNA的直接損傷上，也可能體現(xiàn)在對DNA修復過程的影響。DNA修復主要有兩個經(jīng)典途徑HR和NHEJ。R環(huán)對DNA損傷修復的一個主要影響是改變切除的效率，這一步驟決定了修復由HR還是NHEJ進行。在裂變酵母 中，R環(huán)的形成可防止DSB處的過度切除，但在DSB形成后的早期，R環(huán)的去除也是有效的RPA結(jié)合所必需的。敲低RNase H可以穩(wěn)定DSB位點周圍的RNA-DNA雜交體，并嚴重損害ssDNA結(jié)合RPA復合物的募集。相比之下，過表達RNase H1會破壞這些雜交體的穩(wěn)定性，導致過度的鏈切除和RPA募集以及DSB周圍重復區(qū)域的嚴重丟失[4]。在輕度復制壓力下，XPG處理R環(huán)產(chǎn)生的瞬時DSB導致WS單元中的HR通路下共濟失調(diào)毛細血管擴張突變（ataxia telangiectasiamutated gene, ATM）信號激活及其下游細胞周期檢測點激酶（checkpoint kinase, CHK）1的激活[53-54]，促進DNA修復從而保護基因組的穩(wěn)定性。

3 R環(huán)與疾病

3.1 R環(huán)與非腫瘤性疾病 在人類基因組不穩(wěn)定相關(guān)的多種疾病中發(fā)現(xiàn)了R環(huán)的增加（見表2）。目前有研究表明骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes, MDS）可能既是剪接又是轉(zhuǎn)錄的疾病，其中剪接因子的突變（如U2AF35）誘導的R環(huán)形成，并且形成的R環(huán)與骨髓來源的血液祖細胞增殖受損有關(guān)，促進了MDS的形成[55]。肌萎縮性側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）等神經(jīng)退行性疾病也與R環(huán)形成有關(guān)，患者細胞內(nèi)C9ORF72（C9）基因的第一個內(nèi)含子中富含G的擴展序列可以在置換的DNA鏈（G4-DNA）中形成G四聯(lián)體，從而使優(yōu)先在富含G的位點形成的R環(huán)穩(wěn)定，導致C90RF72基因轉(zhuǎn)錄受損；顯性青少年肌萎縮側(cè)索硬化癥 （ALS4）患者的細胞內(nèi)的SETX基因會發(fā)生突變，導致R環(huán)的減少。ALS4細胞中的R環(huán)越少，轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）的負調(diào)節(jié)因子BAMBI的表達就越低，然后引起TGF-β通路的異常激活，這可能導致運動神經(jīng)元功能障礙和死 亡[56]。Wiskott-Aldrich綜合征（WAS）也與R環(huán)有關(guān)，R環(huán)可能通過影響DNA復制和（或）修復而損害基因組完整性，從而導致兒童白血病的發(fā)病率很高[47]。

表2 R環(huán)影響不同疾病的發(fā)生發(fā)展

3.2 R環(huán)與腫瘤 癌基因的激活通常會啟動產(chǎn)生癌癥特征的異常轉(zhuǎn)錄程序。這種轉(zhuǎn)錄激活導致轉(zhuǎn)錄-復制沖突（tranion-replication conflict, TRC）的可能性是雙重的：首先，快速增殖和高轉(zhuǎn)錄頻率增加了R環(huán)形成的可能性[57]；其次，特定的DNA復制時間，再加上致癌基因誘導的細胞周期進入，可能導致與新獲得的致癌轉(zhuǎn)錄狀態(tài)發(fā)生沖突，從而促進TRC處的R環(huán)[58]。有文獻報道，R環(huán)基因表達水平與癌癥患者的存活率相關(guān)（P＜0.05）[59]。

R環(huán)參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程。尤因肉瘤與R環(huán)關(guān)系比較密切。在尤因肉瘤中，EWS-FLI1融合蛋白的表達增強轉(zhuǎn)錄，導致R環(huán)積累，同時通過增加RNAPII與BRCA1相互作用而損害HR，從而導致基因組不穩(wěn)定[33，60]。在乳腺癌的雌激素受體途徑中，發(fā)現(xiàn)R環(huán)在雌激素誘導的基因上積累并驅(qū)動DNA損傷[61]。乳腺癌易感性因素BRCA1和BRCA2驅(qū)動的通路中的干擾也會引起R環(huán)驅(qū)動的DNA損傷。用致癌性醛處理的細胞會降解BRCA2，進而積累破壞DNA的R環(huán)[62]。這些R環(huán)直接與小鼠的乳腺腫瘤發(fā)生有關(guān)[63]。R環(huán)的存在與基因的不穩(wěn)定性有著很大關(guān)系。在釀酒酵母菌株中發(fā)現(xiàn)，缺少Mlp1/2核籃蛋白的細胞顯示出AID依賴性基因組不穩(wěn)定性和復制缺陷，這些缺陷被RNase H1過表達抑制[64]。通過復制中間體的2-D瓊脂糖凝膠電泳檢測到了同時缺失RNase H和拓撲異構(gòu)酶I（topoisomerase I, topoI）的酵母細胞的rDNA基因座中R環(huán)的復制，并被認為有助于復制數(shù)的變化，這與致癌作用高度相關(guān)[65]。在枯草芽孢桿菌中，復制與轉(zhuǎn)錄的正面碰撞可能導致普遍的R環(huán)形成。此類R環(huán)可以阻止復制，增加誘變作用，并抑制復制重啟和應激生存所需基因的表 達[66]。受調(diào)控的復制是R環(huán)影響細菌的細胞生理和基因組穩(wěn)定性的另一種主要機制[24]。

由于R環(huán)是轉(zhuǎn)錄的常見副產(chǎn)物，因此可以利用癌細胞的R環(huán)耐受性來使某些腫瘤對化學治療敏感，從而重新激活癌癥對R環(huán)結(jié)構(gòu)和內(nèi)源性的反應[59]。R環(huán)介導的遺傳損傷（R環(huán)不耐受）可能使腫瘤更容易受到DNA損傷劑和細胞死亡的影響，這可能會促進涉及細胞毒性療法和R環(huán)靶向藥物的新型聯(lián)合療法的開發(fā)。在滑膜和尤因肉瘤（SS/ES）中，臨床ATR抑制劑（ATR inhibitor, ATRi）的使用導致R環(huán)的積累并增加了對化學療法的敏感性[67]。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP）抑制劑可增強SS細胞ATRi的抗腫瘤活性，這表明使用ATRi的聯(lián)合療法有望成為治療肉瘤的新方法[67]。EWS-FLI融合蛋白已顯示可增加R環(huán)形成并失活，從而使尤因肉瘤細胞系對遺傳毒性藥物（如依托泊苷、喜樹堿和PARP抑制劑）高度敏感[33]。

4 總結(jié)與展望

自R環(huán)被發(fā)現(xiàn)后，針對R環(huán)的檢測技術(shù)更新迭代，從最開始的電泳技術(shù)到后來的免疫沉淀技術(shù)，再到現(xiàn)在在免疫沉淀技術(shù)上發(fā)展的免疫熒光技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，使得我們對R環(huán)能夠更加精確定位，更全面地檢測R環(huán)，從而更好地研究R環(huán)的相關(guān)信息。在腫瘤的治療方法上，已經(jīng)開發(fā)了一些與R環(huán)相關(guān)的療法，并且通過聯(lián)合治療而提高療效。在非腫瘤性疾病中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的某些疾病與R環(huán)的形成有關(guān)，未來有望根據(jù)這些位點或者有針對性地除去這些R環(huán)來治療或者輔助治療這些疾病。雖然病理性R環(huán)與基因組不穩(wěn)定和復制壓力相關(guān)聯(lián)，癌癥和許多遺傳疾病的特征，以及多種神經(jīng)退行性疾病與R環(huán)積累相關(guān)，但我們?nèi)晕丛赗環(huán)與疾病之間建立因果關(guān)系。因此，需要了解R環(huán)穩(wěn)態(tài)的分子基 礎，以及保護細胞不受病理性R環(huán)影響的機制，以理解R環(huán)作為轉(zhuǎn)錄的隱藏面的作用。由于病理性R環(huán)的存在會影響復制和轉(zhuǎn)錄，所以當前針對抑制R環(huán)形成以及減少R環(huán)對基因組影響的因子研究比較多，如RNase H酶、FA途徑等，而針對R環(huán)存在的生理功能研究卻較少。在抑制R環(huán)形成的影響因子中，有許多與DNA修復途徑有關(guān)，例如FA途徑等，說明細胞已經(jīng)進化出不同的因子和機制來防止共轉(zhuǎn)錄R環(huán)的形成，以利于細胞的生存。此外，細胞也進化出了與R環(huán)共存或者說利用R環(huán)參與生理過程的功能，例如R環(huán)導致的SIM，在CpG島上形成的R環(huán)保護這些區(qū)域免受DNA甲基化的影響。雖然我們已經(jīng)探索很多可能影響R環(huán)形成的場景和因素，但是仍然有很多信息不明確，包括：全基因中R環(huán)的分布和存在時間，R環(huán)在轉(zhuǎn)錄沖突中出現(xiàn)的頻率及其影響程度，細胞如何識別生理性R環(huán)與病理性R環(huán)，不同細胞中R環(huán)形成的頻率是否不同。圍繞這一些問題進行研究可以更好地理解R環(huán)在細胞中的生理和病理學意義，為研究R環(huán)的影響因素和相關(guān)疾病的關(guān)系找到新的突破口。