李錚 侯煒

目前，肺癌仍然是全球范圍內(nèi)引起癌癥相關(guān)死亡的主要病因，其中非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌的85%[1]，肺鱗癌是非小細(xì)胞肺癌常見的病理類型之一。大多數(shù)患者確診肺鱗癌時(shí)已為中晚期，5年生存率低于15%[2]。對于晚期肺鱗癌，含鉑雙藥化療仍然是首選方案[3]。盡管靶向治療和免疫治療迅速發(fā)展，只有少部分肺鱗癌患者從治療中獲益[4]。因此積極尋找有效且毒副作用小的藥物及療法仍是研究方向之一。隱丹參酮(cryptotanshinone，CPT)是從中藥丹參根及根莖部位提取的脂溶性化合物，在體外能抑制肺、肝、乳腺、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖[5-8]。但關(guān)于隱丹參酮干預(yù)肺鱗癌的報(bào)道并不多見。本研究用隱丹參酮干預(yù)肺鱗癌KAL△LU細(xì)胞，觀察其對增殖、凋亡、周期以及干性標(biāo)志物干細(xì)胞抗原1(stem cell antigen,Sca-1)的影響，探討隱丹參酮對肺鱗癌KAL△LU細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

KAL△LU細(xì)胞株由美國國立癌癥研究所Dr.Yinling Hu實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑和儀器

隱丹參酮(貨號：S2285)購自于selleck公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(貨號：D2650)、四甲基偶氮唑藍(lán)(measurement of trititaed thymidine incorporation，MTT)(貨號：M2128)購自于Sigma公司；流式凋亡試劑盒(貨號：559763)、PI/RNase染色緩沖液(貨號：550825)、Sca-1-FITC抗體(貨號：562058)購自BD公司。CO2培養(yǎng)箱、多功能全波長酶標(biāo)儀購自于Thermo公司；流式細(xì)胞儀購自于BD公司。以上試劑和儀器由美國國立癌癥研究所Dr.Yinling Hu實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇KAL△LU細(xì)胞，以1×106接種于100 mm培養(yǎng)皿中，加含10%胎牛血清、1%青霉素(1萬單位/mL)、鏈霉素(10000 μg/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基10 mL，5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3天換液1次，用含0.25% 乙二胺四乙酸的胰酶消化后取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞MTT檢測

取對數(shù)生長期KAL△LU細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后分成對照組(DMSO組)與隱丹參酮組(DMSO+隱丹參酮組)，同時(shí)設(shè)空白組。兩組設(shè)不同濃度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔接種5×103KAL△LU細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，分別加入DMSO與DMSO+隱丹參酮并調(diào)整隱丹參酮終濃度為6.25、12.5、25、50 μM。加藥24、48、72小時(shí)后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，培養(yǎng)箱孵育4小時(shí)，加入150 μL的DMSO，1000 r/min震蕩10分鐘，使用酶標(biāo)儀490 nm波長讀取OD值。細(xì)胞存活率(%)=[(隱丹參酮組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)一次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、周期和Sca-1

取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×106接種于100 mm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁后，分別加DMSO與DMSO+隱丹參酮，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，CPT干預(yù)KAL△LU細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度約為25 μM，因此調(diào)整隱丹參酮終濃度為25 μM，培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后收集細(xì)胞上清液至15 mL離心管，培養(yǎng)皿內(nèi)加胰酶消化細(xì)胞，加入適量培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞及培養(yǎng)基至相同離心管，300 g離心5分鐘，棄上清，用冷的PBS洗兩遍。細(xì)胞凋亡：用1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞(>1×106/mL)，取100 μL至流式管，加5 μL的Annexin V 和 2 μL的7-AAD，室溫避光孵育15分鐘，加400 μL的1×結(jié)合緩沖液，1小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測。細(xì)胞周期：用1 mL的PI/RNase 染色緩沖液重懸細(xì)胞，室溫孵育30分鐘，轉(zhuǎn)移至流式管，上機(jī)檢測。Sca-1：加入1 mL 流式緩沖液，調(diào)整濃度為1×106/mL，取100 μL，加入 1 μL的Sca-1-FITC，室溫避光孵育30分鐘，300 g離心5分鐘，重懸于100 μL流式緩沖液中，加200 μL多聚甲醛固定，上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)一次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度隱丹參酮對KAL△LU細(xì)胞增殖的影響

隱丹參酮干預(yù)KAL△LU細(xì)胞后，在12.5、25、50 μM濃度時(shí)可以抑制細(xì)胞增殖，且隨時(shí)間與濃度增加，抑制作用增強(qiáng)。12.5 μM 隱丹參酮干預(yù)24、48、72小時(shí)后細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，25 μM、50 μM隱丹參酮干預(yù)24、48、72小時(shí)后細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)，而6.25 μM隱丹參酮干預(yù)后細(xì)胞存活率無明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 不同濃度隱丹參酮24、48、72小時(shí)KAL△LU細(xì)胞存活率比較

2.2 細(xì)胞凋亡檢測

25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU細(xì)胞24、48、72小時(shí)后， 流式細(xì)胞術(shù)檢測KAL△LU細(xì)胞凋亡情況， 結(jié)果顯示，對照組與隱丹參酮組早期凋亡率比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2、圖1。

圖1 25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU 24、48、72小時(shí)細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖

表2 25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU24、48、72小時(shí)細(xì)胞凋亡率比較

2.3 細(xì)胞周期檢測

25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。結(jié)果顯示，干預(yù)24小時(shí)后，對照組與隱丹參酮組細(xì)胞周期各期均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；干預(yù)48小時(shí)后，與對照組相比，隱丹參酮組G0/G1期比例降低，S期比例增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)； 干預(yù)72小時(shí)后，與對照組相比，隱丹參酮組G0/G1期比例降低，S期比例增加，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。見表3、圖2。

圖2 25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU 24、48、72 小時(shí)細(xì)胞周期圖

表3 25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU24、48、72小時(shí)細(xì)胞周期比較

2.4 細(xì)胞干性標(biāo)志物 Sca-1檢測

25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU細(xì)胞24、48、72 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測Sca-1表達(dá)比例，結(jié)果顯示，與對照組相比，隱丹參酮組在各時(shí)間點(diǎn)Sca-1表達(dá)比例均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖3。

表4 25μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU24、48、72小時(shí)細(xì)胞干性標(biāo)志物 Sca-1比較

圖3 25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU 24、48、72小時(shí)細(xì)胞Sca-1直方圖

3 討論

KAL△LU細(xì)胞株由美國國立癌癥研究所Dr. Yinling Hu實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)立，是從L-IKKαKA/KA自發(fā)性肺鱗癌小鼠將肺部鱗癌組織取出，經(jīng)胰蛋白酶消化處理及分離培養(yǎng)建立而成[9]。KAL△LU細(xì)胞除具有鱗癌細(xì)胞特性外，還表達(dá)Sca-1等細(xì)胞干性標(biāo)志物，與常見的肺鱗癌細(xì)胞株如H520有所不同，因此本研究以KAL△LU細(xì)胞株為研究對象，觀察隱丹參酮對KAL△LU細(xì)胞增殖、凋亡、周期以及干性標(biāo)志物Sca-1的影響。

隱丹參酮是傳統(tǒng)中藥唇形科植物丹參的活性成分之一。本研究結(jié)果顯示，12.5、25、50 μM隱丹參酮在24、48、72小時(shí)均能抑制KAL△LU細(xì)胞增殖，具有濃度和時(shí)間依賴性，體現(xiàn)隱丹參酮有抗肺鱗癌細(xì)胞增殖潛力。已有多項(xiàng)研究[5-6，8，10]表明隱丹參酮在體外可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖。

細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的細(xì)胞自主有序死亡，細(xì)胞凋亡過程失控與腫瘤發(fā)生有一定關(guān)系。隱丹參酮可通過阻滯細(xì)胞周期、線粒體途徑、其他途徑等多種機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[11-12]。但在本研究中，以濃度為25 μM隱丹參酮作用于細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)，均未能顯示隱丹參酮對KAL△LU細(xì)胞有明顯促進(jìn)凋亡作用，說明25 μM隱丹參酮并不能誘導(dǎo)KAL△LU細(xì)胞發(fā)生凋亡。

細(xì)胞正常的分裂、增殖、分化維持著機(jī)體的穩(wěn)定，細(xì)胞周期調(diào)控紊亂會引起腫瘤等疾病，因此 “腫瘤可能是一類細(xì)胞周期性疾病”[13]，針對細(xì)胞周期素依賴性激酶、檢查點(diǎn)激酶等已成為研究熱點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中，隱丹參酮干預(yù)48、72小時(shí)后可阻滯KAL△LU細(xì)胞于S期，從而阻斷細(xì)胞周期向G2/M進(jìn)行。許多研究證實(shí)隱丹參酮可調(diào)控細(xì)胞周期。葉歡等[14]研究表明，40 μM隱丹參酮可將A549細(xì)胞周期阻滯于G1期。Chen等[15]也發(fā)現(xiàn)隱丹參酮干預(yù)乳腺癌和前列腺癌可使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。

Sca-1是小鼠造血干細(xì)胞的標(biāo)志物之一[16]，在多種組織器官如心臟、肝臟、乳腺等的干/祖細(xì)胞表面都有表達(dá)[17]。越來越多研究認(rèn)為，Sca-1并非僅是干/祖細(xì)胞表面分子標(biāo)志物，在其自我更新與分化以及促進(jìn)腫瘤形成方面也起到重要作用[18-19]。有研究表明，在小鼠Lewis肺癌細(xì)胞(Lewis lung carcinoma，LLC)中，Sca-1+LLC比Sca-1-LLC成瘤性強(qiáng)，僅2 ×104即可成瘤，并且Sca-1+LLC耐藥性較 Sca-1-LLC更強(qiáng)[20-21]，提示Sca-1與腫瘤形成與腫瘤耐藥具有一定相關(guān)性。本研究結(jié)果表明，隱丹參酮干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)均可降低Sca-1比例，降低KAL△LU細(xì)胞干性。因此推測，隱丹參酮可能通過降低干性標(biāo)志物Sca-1影響腫瘤形成、減少腫瘤耐藥。

綜上，隱丹參酮能抑制KAL△LU細(xì)胞增殖，具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性，阻滯KAL△LU細(xì)胞周期于S期，降低KAL△LU細(xì)胞干性，在抑制肺鱗癌方面具有一定的潛力，為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供一定參考。但隱丹參酮對KAL△LU細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及Sca-1的直接作用機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步探索。