孫同友，周碩，梁秀軍，武慧杰，廉蕊

1 承德市中心醫(yī)院放化療科，河北 承德 067000；2 承德醫(yī)學院研究生院；3 承德醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所

結(jié)直腸癌（CRC）是人類最常見的惡性腫瘤之一，每年有超過60 萬人死于CRC［1］。5-氟尿嘧啶（5-FU）一直是中晚期CRC 的化療用藥，但腫瘤細胞耐藥和不良反應(yīng)在一定程度上限制了5-FU 應(yīng)用。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）通過與死亡受體結(jié)合選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，而對正常組織和細胞無明顯毒性［2］。但系統(tǒng)注射后，TRAIL 的半衰期過短［3］。此外，約50%的腫瘤細胞株對TRAIL不敏感，從而限制了TRAIL 的臨床應(yīng)用。重組變構(gòu)人TRAIL（mhTRAIL）是由野生型TRAIL變構(gòu)優(yōu)化而來，其性能更優(yōu)［4］。我們課題組前期研究結(jié)果顯示，rmhTRAIL 與5-FU聯(lián)合在CRC中顯示出良好抗腫瘤作用，5-FU 能夠通過上調(diào)HCT116 細胞表面死亡受體5（DR5）表達增強rmhTRAIL 的敏感性［5］。TRAIL受體包括DR4、DR5、誘騙受體1（DcR1）、DcR2 和一個被稱為骨保護素（OPG）的可溶性受體［5］，DR5 作為TRAIL 的特異性受體之一，具有傳導(dǎo)凋亡信號引起細胞凋亡的功能。為了明確DR5 對rmhTRAIL 以及其與5-FU 聯(lián)合抗腫瘤的重要性，本研究選用人CRC細胞HCT116，觀察敲低DR5表達后，rmhTRAIL單藥及其與5-FU 聯(lián)用對細胞增殖及凋亡的影響，以及對凋亡信號通路中相關(guān)蛋白表達的影響，進一步闡明其抗結(jié)直腸癌作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 rmhTRAIL由北京沙東生物技術(shù)有限公司饋贈；5-FU 購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；人CRC 細胞HCT116 由美國哥倫比亞大學惠贈；流式細胞Annexin VFITC/PI 雙染凋亡檢測試劑盒（聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；MTS（美國Promega公司）；鼠抗Caspase-3 單克隆抗體、鼠抗Caspase-8 單克隆抗體、兔抗DR5 抗體、兔抗Caspase-9 抗體、鼠抗βactin 抗體（美國CST 公司）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（美國Proteintech Group 公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierces 公司）；1640 培養(yǎng)液（Gibco）、PBS 緩沖液（HyClone）；FBS（胎牛血清，Gibco）、0.25%含EDTA胰酶（Sigma）。DR5 shRNA 質(zhì)粒、Control shRNA 質(zhì)粒（美國Santa Cruz公司）；嘌呤霉素（美國Santa Cruz公司）。

1.2 細胞培養(yǎng) 人CRC 細胞HCT116，為單層貼壁生長細胞，用完全1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。將HCT116 細胞置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，隔2～3 d傳代1次，細胞消化液為含EDTA的0.25%胰酶溶液。

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 選取處于對數(shù)期生長的HCT116細胞，按濃度2×105/mL 接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，分為空白對照組、Control shRNA 組和DR5 shRNA 組，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，用含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基進行抗性篩選，最終選取2μg/mL嘌呤霉素作為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的篩選濃度。當轉(zhuǎn)染細胞融合度達80%時，將細胞消化轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進行擴大培養(yǎng)，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞分別命名為HCT116/Control shRNA（HCT116/Con）細胞和HCT116/DR5 shRNA（HCT116/KD）細胞。Western blotting法驗證敲低效果。

1.4 細胞增殖檢測 采用MTS 法。①rmhTRAIL或5-FU 單藥對細胞增殖的影響：將處于對數(shù)生長期的HCT116/Con 細胞和HCT116/KD 細胞，用胰酶消化后制成單細胞懸液，分別按5 000/孔接種于96 孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5-FU 的作用濃度分別為1.25、2.5、5、10、20、50、100 μg/mL；rmhTRAIL 的作用濃度分別為1.25、2.5、5、10、50、100 ng/mL，每個濃度均設(shè)3 個復(fù)孔。作用48 h 后，吸除孔內(nèi)原培養(yǎng)液，避光條件下加入配制好的MTS溶液，120μL/孔，然后將細胞放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光培養(yǎng)3 h，利用酶標儀檢測490 nm 波長處各孔的OD 值。根據(jù)細胞的生長抑制率分別計算rmhTRAIL 和5-FU 單藥處理細胞48 h 時的半數(shù)抑制濃度（IC50）。②rmhTRAIL 聯(lián)合5-FU 對細胞增殖的影響：將HCT116/Con 和HCT116/KD 細胞經(jīng)胰酶消化后接種于35 mm培養(yǎng)皿中，過夜貼壁后，分為對照組、5-FU 組、rmhTRAIL 組、rmhTRAIL+5-FU 組，根據(jù)IC50 值選取5-FU 的濃度為5 μg/mL，rmhTRAIL 的濃度為10 ng/mL，藥物處理細胞48 h，MTS法檢測細胞增殖情況，方法同上。細胞生長抑制率（%）=（對照組OD 值-實驗組OD 值）/對照組OD 值×100%。實驗重復(fù)3次。

1.5 細胞凋亡檢測 將HCT116/Con和HCT116/KD細胞經(jīng)胰酶消化后接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，過夜貼壁后，分為對照組、5-FU 組、rmhTRAIL 組、rmhTRAIL+5-FU 組，5-FU 的濃度為5 μg/mL，rmhTRAIL的濃度為10 ng/mL，藥物處理48 h。按照Annexin V-PFITC/PI 雙染流式細胞凋亡檢測試劑盒說明書對各組細胞處理后染色，流式細胞儀（BD FACSCalibur）測算各組細胞凋亡率，實驗重復(fù)3 次統(tǒng)計結(jié)果。

1.6 凋亡通路相關(guān)蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。將HCT116/KD 細胞分為對照組、5-FU組、rmhTRAIL 組、rmhTRAIL+5-FU 組，藥物作用48 h后，PBS 清洗，加入RIPA 裂解液（美國Thermo 公司）充分反應(yīng)，冰上收取裂解液，12 000 r/min 離心20 min（離心半徑10 cm），小心吸取上清，按照BCA蛋白定量試劑盒（中國索萊寶科技有限公司）步驟進行定量，計算總蛋白濃度，加入Loding蛋白變性后進行垂直凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，4 ℃濕盒內(nèi)一抗孵育過夜（一抗的稀釋濃度：DR5、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和PARP按1∶1 000稀釋，β-actin按1∶2 000稀釋），第2 天加二抗（1∶5 000，中國碧云天生物技術(shù)有限公司）室溫孵育1.5 h，ECL 發(fā)光顯影，用全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)曝光掃描，應(yīng)用Image J軟件對蛋白條帶進行分析、測量灰度值，實驗重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布計量資料以-x±s表示，兩組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DR5蛋白在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中的表達 HCT116、HCT116/Con、HCT116/KD 細胞中DR5 的相對表達量分別為1.01 ± 0.16、0.86 ± 0.17、0.04 ± 0.00，HCT116/KD 細胞中DR5 表達低于HCT116 親本株和HCT116/Con 細胞，且敲低效果達90%以上，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。證實敲低DR5 表達的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株構(gòu)建成功。

2.2 敲低DR5 表達對CRC 細胞藥物敏感性的影響

2.2.1 敲低DR5 表達后rmhTRAIL 及5-FU 單藥對CRC 細胞增殖的影響 不同濃度的rmhTRAIL 作用于細胞時，在各濃度組，HCT116/KD細胞的生長抑制率低于HCT116/Con 細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），隨著藥物濃度升高，細胞生長抑制率增加趨勢不如HCT116/Con細胞明顯；而單用不同濃度的5-FU 作用于細胞時，在各濃度組，HCT116/KD 細胞與HCT116/Con 細胞的生長抑制率無統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）。單藥rmhTRAIL 對HCT116/KD 細胞的IC50值高于HCT116/Con 細胞，分別為（65.76 ±4.65）、（5.16±0.12）ng/mL，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而單藥5-FU 對HCT116/KD 細胞和HCT116/Con細胞的IC50值相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），分別為（6.09±0.12）、（6.13±0.63）ng/mL。見表1、2。

表1 敲低DR5表達后不同濃度5-FU作用于細胞的抑制率比較（%，±s）

表1 敲低DR5表達后不同濃度5-FU作用于細胞的抑制率比較（%，±s）

5-FU（μg/mL）1.25 2.5 5 10 20 50 100細胞抑制率HCT116/Con 13.87±0.99 34.47±1.52 49.29±0.08 58.00±0.76 69.07±0.81 89.07±0.30 94.75±0.23 HCT116/KD 13.76±0.93 32.63±0.49 47.69±0.82 58.45±0.96 69.86±0.34 94.17±0.13 97.26±0.33

2.2.2 rmhTRAIL與5-FU聯(lián)合作用于CRC HCT116細胞，MTS 結(jié)果顯示，rmhTRAIL 與5-FU 聯(lián)合作用于HCT116/KD 細胞的增殖抑制率為（56.70 ±1.33）%，低于HCT116/Con細胞的（78.67±0.94）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=23.338，P＜0.01）。

表2 敲低DR5表達后不同濃度rmhTRAIL作用于細胞的抑制率比較（%，±s）

表2 敲低DR5表達后不同濃度rmhTRAIL作用于細胞的抑制率比較（%，±s）

注：與HCT116/Con相比，▼P＜0.01。

rmhTRAIL（μg/mL）1.25 2.5 5 10 50 100細胞抑制率HCT116/Con 10.50±0.49 35.68±1.10 49.29±0.08 63.87±0.23 81.95±0.41 84.85±0.88 HCT116/KD 6.14±0.78▼12.20±0.45▼16.64±1.21▼22.29±1.16▼46.65±1.01▼56.25±1.65▼

2.3 敲低DR5 表達對CRC 細胞凋亡的影響rmhTRAIL 單藥分別作用于HCT116/Con 細胞和HCT116/KD 細胞，凋亡率分別為（62.12 ± 0.32）%和（10.48 ± 1.16）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=74.23，P＜0.01）；rmhTRAIL 聯(lián)合5-FU 分別作用于HCT116/Con細胞和HCT116/KD細胞，凋亡率分別為（85.80±0.0.40）%和（13.33±0.13）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=296.379，P＜0.01）。

2.4 敲低DR5 表達對凋亡通路相關(guān)蛋白表達的影響 敲低DR5 后，無論是rmhTRAIL 單藥，還是rmhTRAIL 與5-FU 聯(lián)用，HCT116/KD 細胞中Caspase-3、Caspase-9、PARP 蛋白表達無明顯下降（P均＞0.05），rmhTRAIL 與5-FU 聯(lián)合導(dǎo)致Caspase-8 表達略有下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；PARP 蛋白裂解片段表達有所上升，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中凋亡通路蛋白相對表達量比較（-x±s）

3 討論

2020 年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，CRC 的發(fā)病率占所有惡性腫瘤發(fā)病的第3 位，病死率占第2 位［6］。手術(shù)結(jié)合放化療的綜合治療使非轉(zhuǎn)移性CRC 患者的生存獲得了穩(wěn)定改善，盡管如此，仍有超過40%的患者會發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移［7］。抑制腫瘤血管生成在惡性腫瘤的治療中取得了較好療效，但是在CRC 中卻進展緩慢。近幾年，免疫治療開啟了惡性腫瘤治療的新篇章，在有MSI-H/dMMR 的轉(zhuǎn)移性CRC（mCRC）中，免疫治療的療效較化療或化療聯(lián)合靶向治療顯著提高［8］，然而，僅有約5%的mCRC 患者表現(xiàn)為MSI-H/dMMR，而不伴有MSI-H/dMMR的mCRC 對免疫治療反應(yīng)性仍較差，因此，尋找新的有效治療CRC藥物或策略迫在眉睫。

mhTRAIL 是北京沙東生物公司開發(fā)并具有獨立知識產(chǎn)權(quán)的新型制劑，屬于Ⅰ類新生物制品，其在溶解性、穩(wěn)定性、半衰期及安全性方面均優(yōu)于野生型TRAIL，在基礎(chǔ)以及臨床試驗中均顯示出較好抗腫瘤效果［9-10］。目前認為，在哺乳動物中主要存在兩條凋亡途徑，外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑，TRAIL 主要通過與其特異性受體DR4 和/或DR5 結(jié)合激活外源性凋亡途徑而誘導(dǎo)細胞凋亡［11］。在Ⅱ型細胞，外源性凋亡途徑激活的Caspase-8可進一步啟動內(nèi)源性凋亡途徑來增強TRAIL 誘導(dǎo)細胞凋亡的能力［11-12］。本課題組前期研究結(jié)果表明，rmhTRAIL 通過與死亡受體結(jié)合導(dǎo)致CRC 細胞發(fā)生了Caspase 依賴性凋亡，在HCT116 細胞，5-FU 通過上調(diào)DR4 和DR5 的表達增強了rmhTRAIL 誘導(dǎo)細胞凋亡的能力。

DR5 是Ⅰ型跨膜蛋白，具有傳導(dǎo)凋亡信號并引起細胞凋亡的功能［13］。有研究顯示，在腎癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌及胃癌中，DR5在TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［14-16］。為了明確DR5 在rmhTRAIL 誘導(dǎo)CRC 細胞凋亡中是否同樣發(fā)揮關(guān)鍵作用，本研究應(yīng)用DR5 shRNA 質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CRC HCT116 細胞，Western blotting 實驗驗證敲低效果，結(jié)果顯示成功構(gòu)建了敲低DR5 的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株HCT116/KD，轉(zhuǎn)染效率在90%以上。

我們前期實驗結(jié)果顯示，rmhTRAIL單藥及其與5-FU 聯(lián)用能明顯抑制親本株HCT116細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。本研究敲低DR5表達后，MTS結(jié)果顯示，rmhTRAIL抑制細胞增殖的作用明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義；當rmhTRAIL 聯(lián)合5-FU作用于細胞時，對HCT116/KD 細胞的生長抑制作用低于HCT116/Con細胞，差異有統(tǒng)計學意義。本研究中流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，DR5被敲低后，rmhTRAIL單藥或者rmhTRAIL聯(lián)合5-FU 誘導(dǎo)的細胞凋亡減少，與HCT116/Con 組細胞比較差異有統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果均表明DR5是rmhTRAIL 抑制HCT116 細胞增殖的基礎(chǔ)，且DR5 是rmhTRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白。

Caspase 家族蛋白酶在細胞凋亡過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，是細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，其參與了凋亡啟動、信號傳導(dǎo)及刺激凋亡效應(yīng)的發(fā)生等過程［17］。因此本研究采用Western blotting 法檢測了凋亡通路中相關(guān)蛋白表達變化，試圖從分子機制上說明DR5 表達的重要性。結(jié)果顯示，DR5 被敲低后，無論是rmhTRAIL 單藥組還是rmhTRAIL 與5-FU 聯(lián)用，細胞中Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9 及PARP蛋白表達無下降或下降不明顯，PARP 蛋白裂解片段表達較對照組表達有所升高，差異有統(tǒng)計學意義，而本課題組前期已發(fā)表的實驗結(jié)果顯示，在未敲低DR5 的親本株HCT116 細胞，rmhTRAIL 單藥或rmhTRAIL與5-FU聯(lián)用均導(dǎo)致Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9 及PARP 蛋白表達明顯下降，PARP 蛋白裂解片段表達顯著上升［5］。表明敲低DR5 表達導(dǎo)致凋亡信號傳遞受阻，即rmhTRAIL 單藥及其與5-FU 聯(lián)用誘導(dǎo)CRC HCT116 細胞凋亡有賴于DR5表達。

綜上所述，本研究采用DR5 shRNA 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CRC 細胞，成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，從細胞水平及分子水平證實，DR5 是rmhTRAIL 單藥及其與5-FU 聯(lián)用誘導(dǎo)細胞凋亡的基礎(chǔ)。敲低DR5 表達后rmhTRAIL 單藥及其聯(lián)合5-FU 干預(yù)HCT116細胞，細胞增殖受抑減弱，凋亡減少。